白藜蘆醇納米結構脂質載體的制備與體外釋放研究

崔欣冉，張程皓，唐景玲（哈爾濱醫科大學藥學院，哈爾濱 150086）

白藜蘆醇（Res）是一種天然多酚化合物[1]，主要分布在藥用植物和食物中，包括虎杖、決明、花生以及葡萄等。它是植物體在逆境或遇到病原侵襲時分泌的一種天然植保素，具有毒副作用小的特點，同時又具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗肺纖維化[2]以及心血管保護等多種藥理效應，潛在的應用前景備受關注。然而，Res難溶于水、穩定性較差且代謝迅速，亟須尋找適宜的載體對其進行改善。

納米結構脂質載體（NLCs）目前已經作為通用載體出現，它是由固體脂質納米粒（SLNs）發展而來的一種新型藥物遞送平臺[3-4]，通過在固體脂質中引入一定比例的液體脂質并將兩者混合制備而成。液體脂質的加入能夠破壞SLNs有序的晶體結構，使NLCs增加更多空間，并可有效防止藥物的泄漏，從而增強載藥能力[5]。相較于其他載體（膠束、納米乳、脂質體），NLCs不僅具備高生物相容性、高穩定性以及高生物利用度等優勢，還能通過調控不同比例的固液脂質比形成穩定的固體骨架結構從而實現更好的藥物控釋[6-8]。因此本研究將Res制備成納米結構脂質載體，旨在提高Res溶解度，增加其穩定性，提高生物利用度，并對白藜蘆醇納米結構脂質載體（Res-NLCs）的體外釋放進行評價，以期為Res的新劑型研究提供理論基礎。

1 材料

1.1 儀器

BSA124S-CW 電子天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）；1260 Infinity 高效液相色譜儀（美國 Agilent 公司）；NanoZS90 光散射粒徑分析儀（英國 Malven 公司）；SZCL-4 數顯智能恒溫磁力攪拌器（上海卓康生物科技有限公司）；Nano微射流均質機（上海諾澤流體科技有限公司）；5430R 低溫超速離心機（德國 Eppendorf 公司）；HZQ-C 空氣浴振蕩器（哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司）。

1.2 試藥

白藜蘆醇（含量＞99%，批號：B1807119，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；大豆磷脂（LEC）（批號：SY-SO-200801，上海艾偉拓醫藥科技有限公司）；吐溫80（Tween-80）（批號：SYSO-200801，天津市富宇精細化工有限公司）；雙硬脂酸甘油酯（GD）（批號：H14M10Z82904，嘉法獅上海貿易有限公司）；辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯（Lab）（批號：F2102301，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；無水乙醇（天津市天力化學試劑有限公司）；甲醇（山東禹王實業有限公司）；乙腈（天津市科密歐化學試劑有限公司）。

2 方法與結果

2.1 Res-NLCs的制備

本實驗選擇毒性低，具有良好乳化能力的GD和LEC作為固體脂質；并對Res在不同液體脂質中的飽和溶解度進行測定，選擇溶解度最高的Lab作為液體脂質，同時以Tween-80作為乳化劑，通過乳化蒸發-高壓均質法制備Res-NLCs。稱取處方量的Res、LEC置于EP管中加入3 mL無水乙醇超聲溶解后待用，將GD、Lab加熱至75℃溶解，然后將脂質與藥物乙醇溶液混合均一使成油相；稱取適量Tween-80置于燒杯中，加入20 mL純化水攪拌均勻使成水相；將油、水兩相同時加熱到75℃后，使油相緩緩滴進保持攪拌的水相中后繼續攪拌，直至有機試劑揮干得初乳；使用均質機，對初乳均質3次循環（6000 psi），完成后冷凍固化得Res-NLCs。

2.2 超濾離心法測定Res-NLCs的包封率和載藥量

2.2.1 超濾離心法藥物回收率 取 400 μL Res 溶液于超濾離心管內管中，13 500 r·min-1低溫離心 30 min，將外管中溶液采用流動相分別稀釋至16、20、24 μg·mL-1，進樣分析，計算Res的回收率。3種不同濃度的Res回收率均在98.48%～101.68%，RSD值均在0.13%～0.29%，符合方法學要求。

2.2.2 Res-NLCs的包封率及載藥量的測定 采用超濾法[9]，取定量Res-NLCs溶液，置于截留分子量為100 kD的超濾離心管內管，并將內外管進行組裝，放入低溫超速離心機離心30 min（13 500 r·min-1、4℃），取外管中分離下來的游離藥物溶液進行稀釋，采用HPLC分析，測得游離Res含量（W1）；同時取Res-NLCs溶液，加入乙腈稀釋同等倍數，超聲15 min進行破乳，通過HPLC分析，即得Res總含量（W2）。

按照下式計算Res-NLCs包封率（EE）及載藥量（DL）：包封率（%）＝[（W2-W1）/W2]×100%；載藥量（%）＝（W3/W4）×100%。其中，W1代表NLCs未包封的藥物含量，W2代表Res的總含量，W3代表NLCs中包封Res的總含量，W4代表Res-NLCs的總重量。

2.3 正交試驗優化Res-NLCs的處方

基于前期單因素篩查所得結果，選擇固液脂質比（A）、Tween-80質量濃度（B）、均質壓力（C）、均質次數（D）4個因素，每個因素設置3個水平，以包封率作為優化指標，設計正交試驗，優化Res-NLCs的處方。設計表見表1。

表1 正交設計因素水平Tab 1 Factor and level of orthogonal experiment

每個因素對指標（EE）的影響程度見表2，由極差（Rj）可知因素影響大小次序為：C＞A＞B＞D，由均值大小可判斷最佳處方為A3B3C2D2。方差分析結果（見表 3）顯示，在以D（均質次數）為誤差項的前提下，因素A（固液脂質比）、B（Tween-80質量濃度）、C（均質壓力）對包封率具有顯著性影響（P＜0.05）。優化后得到的最優處方為：GD用量為0.0356 g，LEC用量為0.3918 g，Tween-80的質量濃度為4.25%，Lab用量為0.0475 g；最佳制備工藝為：均質壓力6000 psi，均質次數30次。按照最優處方平行制備3批Res-NLCs，測得包封率和載藥量的平均值分別為（98.43±0.07）% 和（11.04±0.14）%。

表2 正交試驗結果Tab 2 Orthogonal experiment

表3 方差分析Tab 3 Analysis of variance

2.4 Res-NLCs的外觀形態

將適量新鮮制備的Res-NLCs用純化水稀釋至適當濃度后，取一滴置于覆有支撐膜的銅網上，靜置待其自然干燥，然后用透射電子顯微鏡觀察樣品形貌。Res-NLCs的外觀圖如圖1所示，制劑澄清透明，具有淡藍色乳光。Res-NLCs的透射電鏡結果如圖 2 所示，Res-NLCs呈規則圓球狀，大小均一，無粘連，粒徑較小且分散性良好。

圖1 Res-NLCs的外觀圖Fig 1 Appearance of Res-NLCs

圖2 Res-NLCs的透射電鏡圖Fig 2 Transmission electron microscopy of Res-NLCs

2.5 Res-NLCs粒徑及Zeta電位的測定

采用光散射粒徑分析儀測定Res-NLCs的粒徑及Zeta電位，精密吸取10 μL新制備的最優處方的Res-NLCs，用純化水稀釋至1 mL，混合均勻后，放入儀器測定粒徑及多分散系數（PDI）。結果如圖3 A所示，Res-NLCs的粒徑為（81.87±0.14）nm，PDI為（0.099±0.02）。另取適量Res-NLCs放入樣品池，測定其Zeta電位。結果如圖3B所示，Res-NLCs的Zeta電位為（-8.09±0.75）mV。

圖3 Res-NLCs的粒徑（A）和Zeta電位（B）Fig 3 Particle size（A）and Zeta potential（B）of Res-NLCs

2.6 Res-NLCs的穩定性考察

按照最優處方平行制備3份Res-NLCs，放置于 4℃ 冷藏柜，避光儲存，并分別于 0、1、7、21、30 d測定其包封率和粒徑以考察Res-NLCs的穩定性。結果如圖4所示，在4℃條件下，Res-NLCs的包封率在第21日有所下降，30 d內降至88.52%，粒徑略有上升，表明 Res-NLCs 在此條件下避光儲存21 d基本穩定。

圖4 不同儲存時間對Res-NLCs 包封率和粒徑的影響Fig 4 Effect of different storage time on the EE and DL of Res-NLCs

圖5 白藜蘆醇色譜圖Fig 5 Chromatogram of resveratrol

2.7 Res-NLCs的體外釋藥行為研究

2.7.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（含0.05%磷酸）（68∶32）；柱溫：30℃；檢測波長：305 nm；進樣量：10 μL；流速：1.0 mL·min-1。

2.7.2 溶液的配制

① 空白溶液：配制pH為7.4的含0.3%（w/V）Tween-80的PBS溶液，作為釋放介質。

② 對照品溶液：精密稱取Res對照品10 mg，用釋放介質溶解并定容至50 mL，即得200 μg·mL-1Res的藥物母液。

③ 供試品溶液：移取1 mL Res-NLCs，用釋放介質定容至10 mL，即得。

2.7.3 專屬性試驗 取“2.7.2”項下的空白溶液、對照品溶液、供試品溶液，稀釋至一定濃度后，過濾，進樣，考察NLCs成分以及釋放介質是否干擾藥物含量測定。結果如圖 5所示，Res峰形良好且未見雜峰，表明釋放介質對Res的含量測定無干擾，該方法專屬性符合要求。

2.7.4 線性關系考察 取“2.7.2”項下的對照品溶液，用釋放介質稀釋成0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、15.0和20.0 μg·mL-1系列對照溶液，進樣測定并記錄峰面積（A）。繪制標準曲線，得回歸方程為：A＝57.778C-3.7319，r＝0.9998。結果表明Res在0.1～20.0 μg·mL-1與峰面積線性關系良好。

2.7.5 精密度考察 分別配制低（0.5 μg·mL-1）、中（5.0 μg·mL-1）和高（15.0 μg·mL-1）質量濃度的Res溶液，于1 d內連續5次進樣分析，得日內精密度；5 d內同法進樣，得日間精密度。結果RSD值均在0.30%～1.7%，表明方法的精密度符合要求。

2.7.6 回收試驗考察 取適量Res對照品溶液加入釋放介質中，分別配制成質量濃度為低（7.5 μg·mL-1）、中（12.0 μg·mL-1）和高（15.0 μg·mL-1）的Res溶液，進樣測定，計算回收率。3種不同濃度的Res回收率在98.88%～101.82%，RSD值均在0.26%～0.72%，表明該方法準確度良好。

2.7.7 穩定性考察 將供試品溶液放置于室溫，于24 h內每隔2 h進樣一次，計算出各時間點藥物濃度的RSD。結果得出RSD為0.46%，表明Res供試品溶液放置24 h內穩定性良好。

2.8 Res-NLCs中Res的體外釋藥行為研究

采用正向動態膜透析法[10]考察Res-NLCs的體外釋藥行為，使用0.3%（w/V）Tween-80的PBS（pH 7.4）作為釋放介質。將1 mL Res-NLCs和1 mL Res溶液（溶劑為PEG 400）分別放入透析袋（截留分子量：8～14 kD），將透析袋兩端固定好后放入燒杯中，加入200 mL釋放介質，并保證將透析袋浸沒于液面下，使燒杯保持在恒溫振蕩器內（37℃、100 r·min-1），分別于0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、24、36和48 h 吸取1 mL釋放液，并補加同體積的等溫釋放介質，以保證釋放介質體積一致。樣品經微孔濾膜過濾后，按“2.7.1”項下色譜條件進行含量測定（n＝3），代入以下公式，得Res釋放含量，繪制釋放曲線（見圖6）。

圖6 Res-NLCs及Res溶液中Res的釋放曲線（±s，n＝3）Fig 6 In vitro release curve of Res in Res-NLCs and resveratrol solution（±s，n＝3）

其中Cn為Res在t時刻測得的濃度，Ci為Res在t時刻之前測定的濃度，V0為接收池中加入的溶液體積，V為取樣體積，Q0為起始時Res總量。Res-NLCs和Res溶液在48 h內的釋放曲線如圖6所示，Res溶液釋放相對快速，8 h 內累計釋放97.31%；Res-NLCs在48 h內持續釋放，累計釋放80.69%；Res-NLCs與Res溶液相比明顯釋放緩慢，延長了釋放時間。

同時，還引入 4 種釋放模型對 Res-NLCs的釋放曲線進行模型擬合。結果如表4所示，釋放數據擬合到Makoid-Banakar 模型時R2＝0.9924，表明 Res從 NLCs中的釋放最適合Makoid-Banakar釋放模型，并且相關系數r為0.87，在0.45～0.89，說明 Res 的釋放機制屬于溶蝕與擴散相結合。

表4 Res-NLCs釋放曲線的數學模型擬合Tab 4 Model fitting of release curves of Res-NLCs

3 討論

本試驗采用乳化蒸發-高壓均質法制備Res-NLCs[11]，粒徑較小且分布均勻，同時液體脂質的加入使其具有較高的包封率及載藥量。在Res-NLCs的制備過程中發現，隨著固體脂質比例的增加，包封率逐漸增大，這可能和固體脂質與藥物具有較好的相容性有關；較小劑量液體脂質的加入可以破壞其內部的晶格結構，增加其包封率，但過多液體脂質的加入，可能會降低藥物與脂質之間的相容度，反而導致包封率下降。

在體外釋放試驗中，由于Res水溶性較差，因此需要加入適宜的表面活性劑來改善溶解性。預試驗分別考察了Res在含0.1%～1.0%（w/V）Tween-80的PBS溶液中的飽和溶解度，最終選擇符合漏槽條件的含0.3%（w/V）Tween-80的PBS（pH 7.4）溶液作為釋放介質，當然，這種介質并不能完全代替體內的釋放條件，體內會存在各種代謝酶且具備更復雜的機體機能，可能最終會導致Res-NLCs中藥物的完全釋放。釋放曲線的研究結果表明，Res-NLCs前期釋放相對快速可能歸因于有部分Res吸附在NLCs表面，導致快速滲透；而NLCs中包裹的Res可能以無定形狀態存在于有缺陷的晶格空間或固、液脂質層中，導致釋放相對困難，擴散緩慢[12]，因此Res-NLCs可以顯著延長釋放的時間，展現出良好的緩釋效果，有望改善Res在體內代謝快，吸收差的缺點。本試驗制備的Res-NLCs達到預期提高Res生物利用度的目的，后期將繼續對Res-NLCs體內藥代動力學、體內外藥效學繼續進行研究，以從多方面深入探討Res-NLCs的劑型優勢。