中藥活性肽發現方法研究進展

王鴻杰，王銳，高雯（中國藥科大學 中藥學院，南京 211198）

如何從中藥復雜體系中分離并發現活性先導化合物一直是中藥研究的一大挑戰。目前，植物源中藥小分子研究較為廣泛，且具有較為成熟的活性成分分離和篩選方法，如親和超濾法、生物色譜法、二維渦流色譜法、虛擬篩選法等[1]。然而除小分子外，植物源中藥特別是種子類還含有各種活性肽/蛋白，如核桃仁中發現了含有血管緊張素轉換酶抑制作用、酪氨酸酶抑制作用以及二肽基肽酶Ⅳ抑制作用的多種活性肽[2-4]，枸杞中含有抗腫瘤活性的枸杞環肽[5]，太子參中含有減輕慢性阻塞性肺疾病的作用的太子參環肽[6]等。同時，動物源中藥如水蛭、鱉甲、地龍、鹿茸等含有的多肽和蛋白質被認為是其發揮療效的物質基礎[7]。如水蛭為破血消癥藥，從中發現的水蛭素是迄今為止最強的天然凝血酶抑制劑[8]；鱉甲為補陰藥，從中發現了具有保肝活性的鱉甲七肽[9]；阿膠為補血藥，從中分離出具有刺激造血功能的十一肽[10]。菌類中藥如冬蟲夏草活性肽，具有提高免疫[11]、抗氧化、抗炎[12]等藥理作用，靈芝活性肽具有抗氧化[13]、降壓[14]、抗腫瘤[15]等藥理作用。因此開發活性肽的發現及篩選方法也十分必要。

活性肽是通過酶解、發酵等方式從前體蛋白質水解產生的生物功能超越其營養價值的氨基酸序列片段，其長度通常為2～20個氨基酸殘基，分子量通常小于6 kDa。它們以非活性形式存在于前體蛋白中，水解釋放后具有抗菌、抗氧化、降壓和免疫調節等廣泛生物學活性，并且具有毒性低、易代謝、無耐藥性的特點[16]，用藥前景良好。本文對中藥活性肽純化鑒定的流程以及活性肽篩選新方法進行綜述（見圖1），以期為中藥活性肽的發現提供理論參考。

圖1 活性肽發現流程圖Fig 1 Flowchart of active peptide discovery

1 基于活性導向的多肽分離鑒定法

中藥來源的活性肽包括天然提取活性肽和水解活性肽。天然提取活性肽即天然存在于中藥中的多肽；水解活性肽即蛋白質被水解/酶解/發酵后暴露的具有活性的多肽片段[17]。對于水解活性肽，其制備往往需要將提取到的蛋白質水解成肽段后，再開展分離純化。由于多肽分子量遠小于蛋白質，其分離材料的選擇與分離蛋白略有不同，如超濾膜孔徑（通常＜10 kDa）、凝膠（通常選擇分子量分離范圍1000～5000 Da）等。

1.1 多肽的制備

直接提取法可獲得中藥中的天然提取活性肽。此外，許多活性肽來自蛋白質的結構片段，因此第一步往往需要水解蛋白質暴露活性肽。目前，從蛋白質獲得多肽的常用方法有酶解法、化學水解法、微生物發酵法等，其中，酶解法應用最為廣泛。

1.1.1 酶解法 酶解法即采用一種或多種蛋白水解酶將蛋白質水解為小片段肽，具有條件溫和、結果可控的優點[18]。常見的蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶等。酶對底物具有特異性，不同酶對蛋白質的酶切位點不一樣[19]，因此不同的酶酶解后獲得的多肽分子量、活性可能會有所不同。例如，核桃的胃蛋白酶水解產物具有血管緊張素轉換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制作用，堿性蛋白酶水解產物具有酪氨酸酶抑制作用[2，4]。此外，也可以采用多種酶組合進行酶切，這種方法有助于提高蛋白質水解度[20]，可以獲得更多、更短的多肽片段，有可能提高水解產物活性[21]。值得注意的是，不同的實驗條件對酶解效果有較大的影響，因此需要優化水解溫度、pH、酶底比、時間等條件，根據水解度、生物活性等指標確定最佳酶解條件[22]。

1.1.2 化學水解法 化學水解法即酸堿水解法，通過強酸或強堿催化水解蛋白質肽鍵制備多肽，其水解位點沒有特異性、反應可控性不強，條件極端，易致氨基酸變性，如酸水解會導致色氨酸完全破壞，堿水解會導致大部分氨基酸完全損失[23]。同時化學水解法由于存在安全性、對環境不友好等問題，在活性肽研究過程中運用較少。

1.1.3 微生物發酵法 微生物發酵法是將微生物直接接種于蛋白質中，通過微生物發酵產生的蛋白酶或肽酶將蛋白質水解成多肽或游離氨基酸[24]。發酵法利用微生物的生長特性，將酶的生產和酶的水解過程合二為一，節省了酶的分離和純化步驟，縮短了生產過程，降低了生產成本[22]。不同微生物具有不同的蛋白質水解系統，不同培養物的蛋白質水解產物也不同。Jakubczyk等[25]發現大豆蛋白經植物乳桿菌發酵后，隨著發酵進行，肽含量逐漸增加，發酵后分子量為3.5～7 kDa的部分具有α-淀粉酶抑制活性，IC50值為（1.94±0.16）mg·mL-1。

1.2 活性肽的純化

活性肽的純度對活性肽的理化性質、生物活性和結構鑒定等研究至關重要。因此，對活性肽進行分離純化是不可缺少的一步[20]。

1.2.1 膜分離技術 膜分離技術是利用膜兩側的壓力差截留和分離不同質量的分子，一般作為多肽純化的第一個步驟[26]。根據膜孔徑大小分為微濾、超濾、納濾和反滲透四類，其中超濾因其快速、簡便而被廣泛應用于多肽的純化[23]。選用合適的超濾膜可富集一定分子量范圍的多肽。Luo等[27]應用超濾法初步分離了苦蕎的蛋白水解液，基于實驗發現分子量＜3 kDa的餾分清除自由基活性高于3～10 kDa和＞10 kDa的餾分。Xia等[28]對綠豆蛋白酶解液進行超濾分離，同樣發現低分子量部分（＜3 kDa）具有較強的抗氧化活性，這說明酶解可有效地暴露蛋白質中具有活性的多肽片段，且活性肽存在于低分子量部分。然而，僅采用超濾技術不能分離分子量相近的多肽，實際研究中常與其他分離純化技術相結合[26]。

1.2.2 電泳技術 不同的多肽具有不同的電荷水平，在電場中向電荷極性相反的方向移動的速度不同，從而實現分離[22]。一般來講，電泳技術由于其上樣量太少而較少用于多肽的純化制備[17]，多用于多肽分子量范圍表征或色譜、質譜分析樣品的制備。如Kong等[3]用Tricine-SDS-PAGE對核桃蛋白及其水解產物進行了表征，發現隨著水解程度的增加，高分子量條帶的強度逐漸降低，低分子量條帶的強度逐漸增大。

1.2.3 色譜技術 色譜技術是分離純化活性肽的有效手段，其中凝膠過濾色譜、離子交換色譜和反相高效液相色譜（RP-HPLC）等均較為常用。

① 凝膠過濾色譜（尺寸排阻色譜）：凝膠過濾色譜利用分子篩效應按分子量從大到小分離多肽，該方法一般以水為洗脫劑，條件溫和，可有效保護多肽的生物活性。如Zhao等[29]采用凝膠過濾分離純化鹿茸多肽，共分離得到4個具有抗炎活性的組分。Yang等[30]采用凝膠過濾從紫蘇子蛋白水解物中發現了具有抗氧化活性的組分。

② 離子交換色譜：多肽作為兩性電解質，可以采用離子交換色譜法進行分離[31]。離子交換色譜分離具有較高的分辨率，但洗脫液會引入雜質離子，故其常與凝膠過濾色譜聯用以除去引入的無機鹽。另外，離子交換色譜不適合分離對pH、金屬離子敏感的生物分子[17]。Kong等[3]采用SP Sephadex C-25葡聚糖凝膠柱分離核桃中＜5 kDa的水解多肽，獲得具有二肽基肽酶-Ⅳ（DPP-Ⅳ）抑制活性的組分。Zhang等[32]將牡丹籽超濾液用DEAE-52陰離子交換柱（3.0 cm×40 cm）純化獲得兩個組分（F1和F2），其中F2具有更強的抗氧化活性。

③ RP-HPLC：具有分離效率高、分離能力強、保留機制清晰、餾分活性顯著等特點，尤其適用于分離純化＜5 kDa分子量的極性多肽[22]，常作為多肽分離純化的最后一步。研究者[33]對酸棗水解產物進行3 kDa超濾后，進行RP-HPLC分離，共分離得到7個組分F1～F7，其中F2和F4組分具有最強的ACE抑制活性，IC50分別為0.144 mmol·L-1和0.228 mmol·L-1，經質譜鑒定兩者氨基酸序列分別為IER和IGK。

值得注意的是，上述幾種多肽分離純化技術各有優缺點，單一的分離純化技術并不能完全滿足多肽高效分離純化的要求。故多肽分離純化的實際研究中，常常綜合考慮多肽的多種性質，采用分離組合技術進行分離純化，以達到更好的分離純化效果[26]。

1.3 活性肽的鑒定

為了明確活性肽的結構組成，闡明其構效關系及作用機制，以便開發出合理的活性肽產品，需要進一步鑒定多肽的結構[26]。

1.3.1 活性肽一級結構鑒定 多肽一級結構鑒定方法包括N端測序法、質譜鑒定法等。N端測序法是獲得純度較高的多肽后采用Edman降解進行測序，較為耗時、靈敏度較低且可鑒定的氨基酸殘基數目有限[31]。如Wang等[2]采用N端測序法從核桃水解物中鑒定出兩條ACE抑制肽（VERGRRITSV和FVIEPNITPA）。隨著質譜軟電離技術及二級碎裂技術的發展，N端測序法逐漸被質譜法取代，如電噴霧電離質譜、基質輔助激光解吸質譜等。液質聯用（LC-MS）技術可識別混合物中的多肽，大大減少樣品制備的工作量[34]，同時，生物信息學工具為多肽進行更快、更準確的鑒定提供了可能[35]。此外，基于質譜的從頭測序（De novo）法在多肽的結構鑒定中顯示出顯著優勢，該技術可以在不需要蛋白數據庫的情況下完成未知多肽的測序[36]。例如Memarpoor-Yazdi等[37]借助PEAKS Studio軟件完成了酸棗果實中兩條抗氧化肽VGQHTR、GWLK的從頭測序。此外，核磁法也可用于多肽一級測序，尤其適用于測定氨基酸數量少于30個的肽[38]，如Tian等[39]通過核磁分析從金鐵鎖中成功鑒定了3種新的抗真菌環肽Tunicyclins B～Tunicyclins D。

1.3.2 活性肽二級結構鑒定 活性肽二級結構與其功能密切相關[40]，因此評估活性肽二級結構具有重要的意義。多肽中有序的α螺旋、β折疊、β轉角和無規卷曲構象都具有特征光譜，這些獨特的光譜構成了二級結構分析的基礎[40]。目前常用傅里葉變換紅外技術[41]、磁共振波譜以及圓二色性[40]分析多肽的二級結構，如Zhang等[42]使用傅里葉變換紅外技術分析脫脂花生粉（DPF）與脫脂花生水解物（DPH）中多肽的二級結構，發現兩者主要的二級結構為β型構象，DPF水解為DPH后，α-螺旋由20.93%減少到16.24%，β-折疊由43.54%增加到52.02%。

表1總結了近年來國內外分離鑒定的活性肽及其研究方法。

表1 中藥活性肽研究進展Tab 1 Research progress in active peptides of traditional Chinese medicine

2 活性肽篩選新方法

基于分離純化方法發現活性肽的流程步驟復雜，耗時較長，價格昂貴，制約了中藥活性肽的發現效率，因此亟須開發活性肽篩選的新方法。

2.1 親和篩選及在線鑒定

親和篩選是目前常用的中藥活性成分篩選技術[1]，其根據成分與生物靶標（酶、細胞等）或化學分子特異性結合的特點，從中藥復雜成分中“垂釣”潛在活性成分，并結合LC-MS等高靈敏分析技術，實現篩選和鑒定。如Wang等[56]應用細胞親和技術，從中華蟾蜍毒液中篩選并鑒定了76種腫瘤細胞結合肽。

親和超濾質譜聯用技術，是將親和篩選與膜分離技術相結合，分離出多肽-靶蛋白復合物，解離后再進行鑒定。如Ma等[57]應用生物親和超濾結合LC-Orbitrap-MS/MS技術，篩選并鑒定了紋鱧的7個新型ACE抑制肽，其中EYFR和LPGPGP具有較好的活性。Hu等[58]通過引入變性酶組作為對照以減少假陽性，從草魚鱗明膠水解物中篩選并鑒定了4個新型酪氨酸酶抑制肽，其中DLGFLARGF活性最強，IC50為3.09 mmol·L-1。

固定化親和篩選是將活性靶標（酶或金屬離子等）固定在載體基質上，將混合物中具有潛在活性的組分進行“固定”以與非活性組分分離的方法。如利用過渡金屬離子和一些蛋白質/多肽之間會特異性配位形成螯合物的原理開展親和層析（固定化金屬親和色譜IMAC）篩選，也可首先將靶標固定在磁性微球（Fe3O4等）表面，通過磁固相萃取開展親和篩選。Lan等[59]利用固定了ACE的瓊脂糖磁性微球，從蛇鯔蛋白水解物中有效純化了ACE抑制肽，對ACE抑制的活性由（26.8±1.78）%提高到（83.6±1.35）%，并通過RP-HPLC分離得到IC50＝（47.3±1.4）μmol·L-1的GMKACF。Thewissen等[60]使用Ni2＋-IMAC純化經胰蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶連續水解得到的醇溶蛋白，純化后的組分對ACE抑制活性明顯提高，其IC50為0.02 mg·mL-1。Sun等[61]采用IMAC-Ni2＋色譜柱純化蛇鯔肌肉蛋白酶解物，成功分離出ACE抑制肽RYRP。為了克服IMAC表面的金屬離子對蛋白/多肽等發生的非特異性吸附導致假陽性問題，Liu等[62-63]將聚乙二醇甲基醚（mPEG）修飾在以磁性微球（Fe3O4）為核心的IMAC上，以減少非特異性吸附，從酪蛋白水解物及珍珠貝肉蛋白水解物中篩選出ACE抑制肽，并結合RP-HPLC從富集餾分中分離出了3條新型ACE抑制肽（LLYQEPVLGPVR，HLHT和GWA）。

金屬有機框架（MOF）是一種以金屬離子或金屬離子簇與有機配體通過自組裝形成的高度有序晶體多孔材料[64]，是酶固定化的優良載體。Feng等[65]將ACE固定在Fe3O4@ZIF-90上，固定后的ACE比游離ACE有更好的溫度、pH耐受性及穩定性，并成功從裙帶菜中篩選出一種新型降壓肽KNFL（IC50＝225.87 μmol·L-1）。此外，多肽的金屬螯合活性往往和抗氧化活性有相似性，Chen等[66]應用MIL-53（Cr）結合LC-MS技術，從米渣蛋白水解物中“垂釣”出抗氧化肽GDNMP和LLLRW，兩者清除DPPH自由基活性的IC50分別為（0.120±0.007）mg·mL-1和（0.131±0.008）mg·mL-1。

2.2 基于計算機輔助的虛擬篩選

隨著生物信息學的發展，基于計算機輔助的活性肽虛擬篩選也被廣泛應用。一是基于已知的蛋白氨基酸序列，通過酶切工具進行理論酶切，使用計算機預測工具和生物活性肽數據庫篩選出高活性、低毒性的未知活性肽，并與相關靶標進行分子對接，最后選取得分高的多肽進行后續活性實驗驗證[67]。如石嘉懌等[68]對稻米半胱氨酸蛋白酶抑制劑進行虛擬酶解及虛擬篩選，發現了潛在的生物活性肽TDW和AGR，分子對接顯示兩者具有ACE和DPP-Ⅳ抑制活性。此外，也可以首先基于肽組學完成水解肽的全面表征，再使用計算機預測工具和分子對接進行虛擬篩選，最后通過活性實驗完成驗證。如Zhang等[69]運用肽組學對豌豆酶解產物成功表征543個肽段后，通過DPP-Ⅳ抑制肽特征結構初篩與分子對接虛擬篩選，從中篩選出8條肽段，其中的7條肽段被證明具有較強的DPP-Ⅳ抑制活性。Yu等[70]表征阿膠水解物中519條活性肽后，通過水溶性預測、毒性預測、分子對接以及分子動力學模擬篩選出2條潛在的免疫調節肽（VQLSGEEK和GFSGLDGAKG），并通過體外細胞實驗驗證了其具有免疫增強活性和抗炎活性。相較于其他篩選方法，虛擬篩選省去了大量的實驗步驟，但是需要根據已知結構的蛋白/多肽開展，同時在虛擬篩選中，由于參數設置的多樣化，篩選出的活性肽也會有多重結果，需要結合實驗驗證或進一步發展人工智能預測模型等。

3 結論與展望

本文總結了中藥活性肽發現及篩選方法，基于分離-純化-測試的活性肽發現流程效率較低，因此開發和建立高效的篩選新方法對于活性肽的研究具有重要意義。目前活性肽的快速篩選方法主要包括親和活性篩選以及虛擬篩選，有效提高了中藥活性肽的發現效率。近年來，已有學者提出“活性中藥肽的智慧預測與創制”方法，以基因組大數據為基礎，結合人工智能、計算機虛擬篩選、轉錄組學等現代技術高通量篩選中藥活性肽[71]。此外，多肽在體內是否能有效發揮活性也值得關注，例如口服給藥由于胃腸道消化、結構功能屏障等致生物利用度差；皮膚給藥需要克服皮膚生理屏障[72]等。因此，除了開發活性肽篩選新策略提高活性肽發現效率，研究多肽藥物的體內過程及給藥方案，確保有效性也十分必要。