離子色譜法測定別嘌醇中嗎啉殘留

趙曉亞，鄭文惠，耿一楠，劉曉，常艷，丁俊飛（華潤雙鶴藥業(yè)股份有限公司，北京 101111）

別嘌醇（allopurinol），化學名為1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-醇，是臨床上治療痛風的常用藥物[1]。此外，研究表明別嘌醇對腎病也有良好的治療效果[2]，還可作為腫瘤溶解綜合征低危患者和血尿酸正常的中危患者的首選初始藥物[3]。別嘌醇治療痛風的主要藥用原理是別嘌醇及其代謝產(chǎn)物氧嘌呤醇通過抑制黃嘌呤氧化酶的活性，使尿酸生成減少[4]。目前，別嘌醇常用的工業(yè)化合成路線如圖1所示[5-6]。其中，別嘌醇合成工藝中的重要起始物料嗎啉，在后續(xù)反應(yīng)中可通過精制去除。由于別嘌醇常采用“一鍋法”合成路線，即生成5-氨基-1-H-吡唑-4-甲酰胺半硫酸鹽[5]，合成路線較短，有殘留嗎啉的風險，因此需嚴格控制嗎啉殘留量。參考致癌效力數(shù)據(jù)庫（CPDB）提供的1547種化合物結(jié)構(gòu)[7]，嗎啉結(jié)構(gòu)與1，4二氧己環(huán)結(jié)構(gòu)類似，具有潛在警示結(jié)構(gòu)。因此，按照潛在致突變性雜質(zhì)的要求制定嗎啉限度為1.8 μg·g-1[8]。

圖1 別嘌醇原料藥的工藝路線Fig 1 Process route of allopurinol API

目前，別嘌醇及其制劑的雜質(zhì)相關(guān)研究內(nèi)容較多[9-10]，但尚未發(fā)現(xiàn)對別嘌醇中嗎啉進行檢測的標準[11-13]或文獻。嗎啉檢測通常采用氣相色譜法[14-15]、離子色譜法[16]、液相色譜法[17]等分析方法，其中，離子色譜法具有簡便、快速、靈敏度高，以及對強堿溶液的強耐受性等優(yōu)點。本研究基于離子色譜法測定別嘌醇中的痕量嗎啉，該法靈敏度高、專屬性好、準確度高，不僅能夠較好地滿足別嘌醇中嗎啉的質(zhì)量控制要求，為別嘌醇質(zhì)量標準的提升提供了科學依據(jù)，同時也為其他化合物中嗎啉的檢測提供了參考方法。

1 材料

1.1 儀器

ICS5000型離子色譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）；Mettler ToledoXP205 電子分析天平（十萬分之一，梅特勒-托利多國際有限公司）；CS12陽離子色譜柱（250 mm×4.0 mm，美國賽默飛世爾科技公司）；Dionex OnGuard Ⅱ H固相萃取小柱（美國戴安公司）。

1.2 試藥

嗎啉對照品（色譜級，批號：5002D30W，含量：99.6%，Alfa Aesar化學有限公司）；別嘌醇原料藥[批號：4019Ⅱ181101，含量：99.4%；批號：4019Ⅱ181102，含量：99.5%；批號：4019Ⅱ181103，含量：98.9%，華潤雙鶴藥業(yè)（商丘）有限責任公司]；甲烷磺酸（分析純，北京伊諾凱科技有限公司）；氫氧化鋰（分析純，中國醫(yī)藥集團有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用IonPac CS12（250 mm×4.0 mm）陽離子色譜柱為分析柱，IonPac CG12（50 mm×4.0 mm）為保護柱；以8 mmol·L-1甲烷磺酸溶液為淋洗液A，40 mmol·L-1甲烷磺酸溶液為淋洗液B，梯度洗脫程序見表1；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：500 μL；抑制器：CERS 300（4 mm）；抑制電流為161 mA；柱溫為30℃。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution procedure

2.2 溶液配制

2.2.1 稀釋劑 取 0.01 mol·L-1氫氧化鋰溶液，用H型固相萃取小柱濾過，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取別嘌醇40 mg置10 mL量瓶中，加約3/4量瓶體積稀釋劑，置90℃加熱1 h溶解，放冷，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，冰箱放置1 h后，用0.45 μm聚醚砜濾膜濾過，即得。

2.2.3 對照品儲備液 精密稱取嗎啉36 mg，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，移取1 mL，置100 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，再移取1 mL，置50 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 對照品溶液 精密移取對照品儲備液1 mL置10 mL量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 專屬性與系統(tǒng)適用性試驗

分別取稀釋劑、對照品溶液和供試品溶液各500 μL，進樣分析，記錄色譜圖見圖2。結(jié)果顯示，稀釋劑和別嘌醇均不干擾嗎啉檢測，嗎啉的保留時間為16.840 min，該色譜條件下與相鄰雜質(zhì)峰最小分離度為1.5；連續(xù)6針對照品溶液色譜圖中嗎啉峰面積RSD為1.5%，供試品溶液前后兩針對照品溶液色譜圖中嗎啉峰面積RD為3.7%。結(jié)果表明該方法專屬性與系統(tǒng)適用性良好。

圖2 稀釋劑、對照品溶液及供試品溶液離子色譜圖Fig 2 Ion chromatograms of diluent，standard solution and sample solution

2.4 檢測限（LOD）和定量限（LOQ）

取嗎啉對照品儲備液，用稀釋劑逐級稀釋合適的倍數(shù)后進行測試，以信噪比（S/N）約為10時的進樣濃度為其定量限，繼續(xù)稀釋，以S/N約為3時的進樣濃度為其檢測限。結(jié)果顯示嗎啉的定量限質(zhì)量濃度為1.487 ng·mL-1，相當于供試品質(zhì)量濃度0.37 μg·g-1，檢測限質(zhì)量濃度為0.5558 ng·mL-1，相當于供試品質(zhì)量濃度0.14 μg·g-1。

2.5 線性關(guān)系考察

取對照品儲備液，分別稀釋制成含嗎啉0.001 487～0.014 87 μg·mL-1的系列溶液，分別精密量取線性溶液各500 μL，注入離子色譜儀，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（X，μg·mL-1）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，進行線性回歸。結(jié)果顯示嗎啉線性回歸方程為：Y＝1.107X-0.0004，r＝0.9991，Y軸截距占100%響應(yīng)值的百分比為5.2%。嗎啉在0.001 487～0.014 87 μg·mL-1內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.6 加樣回收試驗

精密稱取別嘌醇（4019Ⅱ181103批次）40 mg，平行10份，分別置10 mL量瓶中，按照3個濃度準確加入對照品儲備液，加稀釋劑至3/4量瓶體積，置90℃加熱1 h，溶解，放冷，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，冰箱放置1 h后，用0.45 μm聚醚砜濾膜濾過，作為50%、100%、150%濃度水平的加樣回收試驗溶液，每個濃度水平平行配制3份，進樣測定。結(jié)果回收率均在89.99%～118.00%，RSD均小于9.0%，所建立的方法的回收率較好（見表2）。

表2 加樣回收試驗Tab 2 Recoveries

2.7 重復(fù)性考察

取“2.6”項下100%水平回收率溶液作為加標供試品溶液，注入離子色譜儀，分別測定6份加標供試品溶液中嗎啉的含量。結(jié)果表明6份重復(fù)性溶液中嗎啉含量均值為1.8 μg·g-1，RSD為12.3%。表明本方法具有良好的重復(fù)性。

2.8 穩(wěn)定性考察

對照品溶液在室溫下放置46.5 h，各時間點峰面積與0 h峰面積的變化值均在0.0%～3.8%，表明對照品溶液在46.5 h內(nèi)穩(wěn)定。加標供試品溶液在室溫下放置38 h后，各時間點峰面積與0 h峰面積的變化值均在1.2%～3.8%內(nèi)，表明加標供試品溶液在38 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 耐用性試驗

取100%水平回收率溶液作為加標供試品溶液，分別用不同色譜柱、不同流速0.9～1.1 mL·min-1、不同日期以及不同實驗員操作，其他條件不變，測定加標供試品溶液中嗎啉的含量。結(jié)果表明，與原條件結(jié)果比較，RD在0.0%～10.5%。因此，色譜條件發(fā)生微小變化不影響嗎啉的檢測，耐用性良好。

2.10 樣品中嗎啉含量測定

分別取4019Ⅱ181101、4019Ⅱ181102、4019Ⅱ-181103批次別嘌醇原料藥配制供試品溶液，按外標法以峰面積計算嗎啉的含量。結(jié)果顯示，3批別嘌醇供試品中均未檢出嗎啉。

3 討論

3.1 檢測方法選擇

目前，嗎啉檢測通常以氣相色譜法為主，采用溶液直接進樣，結(jié)合氫火焰離子化檢測器[14-15]。但文獻報道基于氣相色譜法檢測嗎啉檢出限最低為2.01 μg·mL-1[14]，靈敏度較低。離子色譜法[18-20]具有簡便、快速、靈敏度高，以及對強堿溶液的強耐受性等優(yōu)點。張于等[16]曾采用離子色譜-間接紫外檢測法對實驗室合成的嗎啉樣品進行分析，且檢測限小于0.45 ng·mL-1。本研究直接選用離子色譜-電導檢測器法對別嘌醇中痕量嗎啉進行檢測，無需結(jié)合紫外檢測器，檢測限低，結(jié)果準確可靠。

3.2 溶劑選擇

2020年版《中國藥典》載明別嘌醇在0.1 mol·L-1氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液中易溶[8]，但鈉離子和鉀離子在該色譜柱體系下，與嗎啉分離較差。經(jīng)篩選，發(fā)現(xiàn)采用0.01 mol·L-1氫氧化鋰，以H型固相萃取小柱濾過后的溶液為溶劑時，別嘌醇能夠溶解完全，且鋰離子和嗎啉的分離得到了極大改善。本研究最終選用0.01 mol·L-1氫氧化鋰為溶劑。該溶劑的合理選擇和處理方法，為本方法開發(fā)成功的關(guān)鍵性因素。

3.3 淋洗液條件優(yōu)化

本研究對淋洗液的濃度和梯度分別進行了考察。結(jié)果表明采用8 mmol·L-1甲烷磺酸溶液為淋洗液，等度洗脫，運行時間為180 min時，樣品中的所有雜質(zhì)才能完全洗脫。但以8 mmol·L-1和40 mmol·L-1甲烷磺酸溶液為淋洗液進行梯度洗脫時，45 min內(nèi)能將樣品中所有的雜質(zhì)完全洗脫，且65 min內(nèi)可完全平衡回初始梯度，極大地節(jié)省了檢測時間。

3.4 小結(jié)

本文采用離子色譜法實現(xiàn)了別嘌醇中嗎啉進行有效的控制，按照潛在致突變性雜質(zhì)的要求制定嗎啉限度為1.8 μg·g-1[8]，方法學考察結(jié)果表明，在此試驗條件下，嗎啉在0.001 487～0.014 87 μg·mL-1與峰面積線性關(guān)系良好，檢測限為0.5558 ng·mL-1，專屬性強、靈敏度高，可有效避免樣品假陰性，滿足雜質(zhì)定量檢測要求，可作為別嘌醇中痕量嗎啉的質(zhì)量控制方法，同時也可以作為其他化合物中嗎啉含量測定的參考方法。