高效液相色譜法測定醋酸氟卡尼片的含量

徐碩，鄺詠梅，徐文峰，金鵬飛（北京醫院藥學部，國家老年醫學中心，中國醫學科學院老年醫學研究院，北京市藥物臨床風險與個體化應用評價重點實驗室（北京醫院），北京 100730）

氟卡尼是鈉通道阻滯藥，屬于Ⅰc類抗心律失常藥。醋酸氟卡尼片主要用于治療室性心律失常，包括室性期前收縮及室性心動過速、室上性期前收縮、室上性心動過速、心房撲動、心房顫動、預激綜合征合并室上性心動過速等[1-4]。醋酸氟卡尼片收載于《美國藥典》[5]和《日本藥典》[6]。目前，該藥還沒有在我國上市，也未在《中國藥典》中收載。關于醋酸氟卡尼片的研究主要集中在藥理作用，其含量測定方面的研究報道非常有限，僅有一篇早期的報道[7]，采用HPLC法和紫外分光光度法進行定量。利用HPLC法是通過內標法測定，溶液配制操作復雜。文獻報道以及《日本藥典》收載的以紫外分光光度法測定醋酸氟卡尼含量，其專屬性相對較差，《美國藥典》中是采用HPLC法，流動相為高濃度緩沖鹽溶液，梯度洗脫，該方法于2019年進行修訂并沿用至今。而在此之前《美國藥典》[8]中收錄的方法為采用C8分析柱，并且用四相混合溶液的復雜流動相體系，不利于色譜柱和液相系統的長時間運行。因此，有必要建立一種普適性強并且快速簡便的方法，用于醋酸氟卡尼片中醋酸氟卡尼的定量分析。本研究通過HPLC技術，建立了醋酸氟卡尼片的含量測定方法，該方法簡便、快速、準確，可為該藥品的質量評價提供科學依據，現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀 [Agilent 1260型，包括四元梯度泵（G1311C），自動進樣器（G1329B），柱溫箱（G1316A），二極管陣列檢測器（DAD）（G4212B），色譜工作站（LC OpenLAB），美國Agilent Technologies有限公司]；電子分析天平（XP-205型，精度：十萬分之一，瑞士Mettler Toledo集團）；SPX-250 IC微電腦人工氣候箱（上海博迅實業有限公司）；數控超聲波清洗器（KQ-300DB型，昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

乙腈、磷酸（Thermo Fisher Scientific有限公司產品，色譜純，批號分別為192855、158625）；磷酸二氫銨、冰醋酸、鹽酸、30%過氧化氫（國藥集團化學試劑有限公司產品，分析純），氫氧化鈉（北京化工廠，分析純）；水為二級實驗用水。醋酸氟卡尼對照品 [批號：G0K124，純度：99.7%，USP]；醋酸氟卡尼片（規格：含醋酸氟卡尼100 mg/片，批號：GUL050A、GUD052B、GTB072E，英國Inova Pharmaceuticals公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱采用Alltima C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.02 mol·L-1磷酸二氫銨溶液（含0.2%三乙胺）（用磷酸調至pH 3.0）（35∶65）；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為300 nm；柱溫為30℃；進樣量為10 μL。

2.2 對照品溶液的配制

精密稱取醋酸氟卡尼對照品適量，置于500 mL量瓶中，加入2%冰醋酸溶液40 mL，超聲使其溶解，再加入流動相稀釋至刻度，即得質量濃度約為2 mg·mL-1的對照品儲備液。分別精密量取對照品儲備液2.5、4、5、6、7.5 mL，置于25 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得5個不同濃度的線性系列溶液（質量濃度分別為196.0、313.6、392、470.4、588.0 μg·mL-1）。將中間濃度的溶液（392 μg·mL-1）作為標準工作液，用作方法的系統適用性考察。

2.3 供試品溶液的配制

取醋酸氟卡尼片20片，精密稱定，將其置于乳缽中研細，精密稱取約相當于醋酸氟卡尼100 mg的樣品（約為0.26 g），置于250 mL量瓶中，加入2%冰醋酸溶液20 mL，超聲提取（功率為300 W，頻率為40 kHz）30 min，再加流動相定容至刻度，搖勻，經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即為供試品溶液。

2.4 陰性樣品溶液的配制

依據醋酸氟卡尼片藥品說明書提供的配方制得的不含醋酸氟卡尼的粉末作為陰性樣品。精密稱定該粉末適量，按照“2.3”項下方法操作，即得陰性樣品溶液。

2.5 系統適用性、線性關系考察、檢測限和定量限

在“2.1”項色譜條件下，將標準工作液連續進樣6次，醋酸氟卡尼色譜峰的平均理論塔板數為（4839.3±10.3）（n＝6）。精密吸取“2.2”項下5個不同濃度的對照品溶液各10 μL，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，記錄醋酸氟卡尼峰面積，以該成分的質量濃度（μg·mL-1）為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），進行回歸分析，得到回歸方程為：Y＝3.549X＋3.566，r＝1.000，醋酸氟卡尼在196.0～588.0 μg·mL-1與峰面積呈良好的線性關系。

取質量濃度為196.0 μg·mL-1的對照品溶液，加入流動相進行稀釋，進樣測定，以低濃度對照品信噪比約為3.0和10.0時的濃度分別作為檢測限（LOD）和定量限（LOQ），結果醋酸氟卡尼的LOD為0.061 μg·mL-1，LOQ為0.196 μg·mL-1。

2.6 專屬性試驗

2.6.1 基質干擾試驗 精密吸取上述陰性樣品溶液、醋酸氟卡尼對照品溶液以及供試品溶液各10μL，進樣分析，按照“2.1”項下色譜條件檢測，結果顯示樣品中的輔料不干擾醋酸氟卡尼的測定（見圖1）。

圖1 陰性樣品溶液（A）、對照品溶液（B）和供試品溶液（C）的HPLC色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms of negative sample solution（A），reference substance solution（B）and sample solution（C）

2.6.2 強制降解試驗 為進一步考察方法的專屬性，對供試品進行強制降解試驗，參照國際通行的人用藥品注冊技術要求國際協調會（ICH）方法學驗證原則進行[9-10]。考察的條件包括酸化、堿化、光照、氧化和高溫。取醋酸氟卡尼片（批號：GUL050A）樣品粉末，精密稱定5份，每份約為0.26 g（約相當于醋酸氟卡尼100 mg），置于250 mL量瓶中，進行處理如下：

① 酸降解：分別配制濃度為1 mol·L-1的鹽酸溶液和1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液，量取1 mol·L-1的鹽酸溶液2 mL加入樣品中，置于室溫條件下放置6 h后，加入1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液，使其中和至中性，依照“2.3”項下方法操作，制得供試品溶液。② 堿降解：量取2 mL 1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液加入樣品中，置于室溫條件下放置6 h后，加入1 mol·L-1的鹽酸溶液，使其中和至中性，按照“2.3”項下方法操作，制得供試品溶液。③ 光降解：將樣品放入微電腦人工氣候箱中，光照強度設置為10 000 lx，在該條件下照射6 h，依照“2.3”項下方法操作，制得供試品溶液。④ 氧化降解：在樣品中加30%過氧化氫溶液2 mL，室溫下放置6 h，依照“2.3”項下方法操作，制得供試品溶液。⑤ 高溫降解：將樣品放入烘箱中，80℃加熱6 h，取出，待其冷卻到室溫后，依照“2.3”項下方法操作，制得供試品溶液。

將上述溶液各進樣10 μL，在“2.1”項色譜條件下進行檢測。結果顯示：與未經過強制降解試驗的樣品比較，醋酸氟卡尼在高溫條件較為穩定，未發生降解；在光照、堿化、酸化及氧化條件下有所降解，色譜峰峰面積略有降低，氧化條件下降解較為明顯，可見降解產物色譜峰，但對醋酸氟卡尼的定量分析不會造成干擾（見圖2）。

圖2 醋酸氟卡尼片樣品強制降解試驗HPLC色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram of forced degradation test for flecainide acetate tablets samples

2.7 精密度試驗

取批號為GUL050A的醋酸氟卡尼片制得的供試品溶液，連續進樣6針，記錄峰面積，結果醋酸氟卡尼色譜峰峰面積的RSD值為0.14%（n＝6），表明精密度良好。

2.8 重復性試驗

精密稱取批號為GUL050A的醋酸氟卡尼片樣品6份，每份約為0.26 g，按照“2.3”項下方法操作，制得供試品溶液，進樣分析，以外標法計算含量，結果醋酸氟卡尼的平均含量為98.15%，RSD值為0.53%（n＝6），表明該方法具有良好的重復性。

2.9 穩定性試驗

取批號為GUL050A的供試品溶液，置于室溫條件下，分別在配制后的0、2、4、8、12、24 h進樣檢測，記錄峰面積值，計算醋酸氟卡尼色譜峰峰面積的RSD值為0.49%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內具有良好的穩定性。

2.10 加樣回收試驗

取批號為GUL050A的樣品，研細，精密稱取粉末9份，每份約為0.13 g，分別精密加入“2.2”項下對照品儲備液20、25、30 mL，按照“2.3”項下方法制備，每個濃度制備3份樣品，進樣測定，計算回收率和RSD，結果如表1所示。

表1 回收試驗結果Tab 1 Recovery test

2.11 耐用性考察

分別采用Alltima C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）、Shimadzu C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm）、Waters C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）進行試驗，結果顯示不同品牌色譜柱對醋酸氟卡尼的保留時間、峰形無影響。改變色譜條件中的柱溫（30±2）℃，結果顯示醋酸氟卡尼保留時間基本不變，RSD為0.63%。改變色譜條件中的流速[（1.0±0.2）mL·min-1]，醋酸氟卡尼的保留時間分別為4.0、4.9、6.1 min。結果表明本方法的HPLC條件耐用性良好，色譜參數的微調不會影響檢測結果。

2.12 樣品含量測定

采用已建立的方法測定了3批醋酸氟卡尼片，每批樣品精密稱取2份，按照“2.3”項下方法制得供試品溶液，進樣分析，計算醋酸氟卡尼含量，取平均值作為含量測定結果，見表2。

表2 樣品中醋酸氟卡尼的含量Tab 2 Content of flecainide acetate in samples

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

設定醋酸氟卡尼的檢測波長是根據其在流動相中的紫外吸收譜圖，譜圖顯示該成分的最大吸收為204 nm和300 nm，將300 nm選定為含量測定的檢測波長。

3.2 色譜條件的優化

考察不同流動相體系[乙腈-0.1 mol·L-1磷酸二氫鈉溶液（用磷酸調至pH 3.0）、乙腈-0.05 mol·L-1醋酸銨溶液（用冰醋酸調至pH 3.0）、乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫銨溶液（含0.1%辛烷磺酸鈉）（用磷酸調至pH 3.0）、乙腈-0.02 mol·L-1磷酸二氫銨溶液（用磷酸調至pH 3.0）、乙腈-0.02 mol·L-1磷酸二氫銨溶液（含0.2%三乙胺）（用磷酸調至pH 3.0）]對醋酸氟卡尼色譜峰的影響，結果表明將乙腈-0.02 mol·L-1磷酸二氫銨溶液（含0.2%三乙胺）（用磷酸調至pH 3.0）作為流動相時待測成分峰形較好，理論塔板數大于4500，將其選定為流動相。考察了以乙腈-0.02 mol·L-1磷酸二氫銨溶液（含0.2%三乙胺）（用磷酸調至pH 3.0）作為流動相，調整有機相和水相不同比例，以及設定不同流速（0.5、0.8、1.0 mL·min-1）對待測成分保留時間的影響，結果顯示當乙腈和水相的比例為35∶65，流速采用1.0 mL·min-1時，醋酸氟卡尼的保留時間約為5 min，較為合適。

3.3 提取溶劑的選擇

在含量測定分析中選擇常用的超聲提取法作為樣品的提取方法，比較了以乙腈、甲醇、2%冰醋酸溶液、0.2%冰醋酸溶液作為提取溶劑的影響，結果表明用2%冰醋酸溶液20 mL作為提取溶劑能夠提取完全，之后再加流動相稀釋至刻度能使色譜峰峰形良好。

3.4 樣品取樣量的選擇

制備供試品溶液時，對稱取不同樣品粉末量（約相當于醋酸氟卡尼25、100、250 mg）進行比較，結果顯示當稱取量約為相當于醋酸氟卡尼100 mg，加2%冰醋酸溶液20 mL，再用流動相稀釋至250 mL時目標測定成分具有合適的響應值。

3.5 測定方法的改進

現行版《日本藥典》[6]以及文獻報道[7]的醋酸氟卡尼片含量測定方法為采用紫外分光光度法，儀器設備和操作比較簡單，但其專屬性不如HPLC法。文獻中是通過吸光系數法進行定量，未配制對照品溶液，吸光系數法有可能造成測定結果的不準確，如果雜質或輔料在選定的測定波長處有吸收，則會導致結果偏高。HPLC法具有定量準確、分離性能高、專屬性強等特點，在藥品定量分析中具有一定優勢[11]。《美國藥典》[5]中收載的醋酸氟卡尼片，是通過HPLC法測定其含量，流動相為乙腈-100 mmol·L-1乙酸銨溶液（用乙酸調pH至5.4），梯度洗脫，該方法于2019年修訂并沿用至今，緩沖鹽的濃度較高，長時間運行有可能引起鹽析出，堵塞色譜柱或管路；梯度洗脫需要平衡色譜柱，用時相對較長。而在修訂之前《美國藥典》[8]的方法是以乙腈-冰醋酸-四丁基氫氧化銨-甲醇的混合溶液為流動相，溶液配制復雜，四丁基氫氧化銨為離子對試劑，長期運行對色譜柱和液相系統的損傷較大，且使用后會使柱平衡時間延長，平衡時間不夠可能對實驗的重復性造成影響；并且采用C8分析柱，相比于HPLC法最常用的C18柱，不利于方法的推廣應用。文獻報道[7]的HPLC法是采用內標法，需配制胺碘酮內標溶液，樣品前處理溶液配制操作和結果計算相對較為耗時，流動相采用67 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液，濃度較高，對色譜系統的長期運行有一定損害。本研究采用乙腈-20 mmol·L-1磷酸二氫銨溶液為流動相，緩沖鹽濃度較低，有利于液相系統的長時間運行和樣品的連續測定，與用更高濃度的緩沖鹽進行比較，結果顯示20 mmol·L-1磷酸二氫銨溶液即可獲得較好的峰形。采用等度洗脫的方式能夠節省時間，可在10 min之內完成測定，經專屬性試驗，樣品中的輔料和強制降解產物不干擾目標成分的定量分析。采用外標法定量，相比于內標法，樣品前處理溶液配制過程以及測定結果計算簡便快捷。