長鏈非編碼RNA PTENP1 通過miR-3611/ PTEN 基因途徑調控宮頸癌進程的分子機制研究

包利利 趙 達 俞 巖 周俏苗▲

1.海南醫學院第一臨床學院，海南海口 570216；2.海南省婦女兒童醫學中心婦科，海南海口 570100

宮頸癌是女性癌癥中第四大常見的癌癥[1-2]。盡管手術及放化療方法在過去幾十年里逐漸被應用于宮頸癌的治療，但其5 年預后情況仍較差[3]。因此，深入開展宮頸癌機制探討對改善宮頸癌患者的預后及新療法的開發具有重要意義。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）具有染色質修飾、轉錄、剪接和表觀遺傳調控等多種生物學功能[4-7]。多項研究表明，lncRNA 可以調節DNA 甲基化、組蛋白修飾、染色質重塑，并作為微RNA（microRNA，miRNA）的前體調控腫瘤的發生[8-9]。近期研究表明，lncRNA 通過內源性競爭RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）機制調控miRNA 對靶基因的抑制作用，參與癌癥調控過程[10]。lncRNA PTENP1（以下簡稱“PTENP1”）是腫瘤抑制因子PTEN 基因的“假基因”，在許多惡性腫瘤中通過調節PTEN 基因的表達發揮其抑制腫瘤的功能，但其在宮頸癌中的作用尚不清楚[11-14]。因此本研究旨在探討PTENP1 在宮頸癌進程中的作用及其機制，為宮頸癌的早期篩查及靶向治療提供依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本研究選取54 例2019 年1 月至2022 年12 月在海南省婦女兒童醫學中心確診的宮頸癌患者，收集其癌組織和癌旁組織（與腫瘤組織距離≥5 cm）。患者年齡（45.34±12.73）歲，腫瘤分期Ⅰ～Ⅱ期27 例，Ⅲ～Ⅳ期27 例。納入標準：①經病理診斷為宮頸癌；②資料完整。排除標準：①遠處轉移；②合并其他惡性腫瘤；③妊娠期或哺乳期；④手術前經過放化療處理。本研究經過海南省婦女兒童醫學中心醫學倫理學委員會批準（HNWCMC 倫審2022 年第[136]號）。

1.2 細胞系選擇與培養

宮頸癌細胞系（HeLa、SiHa、C33A、Caski）、正常宮頸上皮細胞H8 及293T 細胞均購自中國科學院上海生命科學研究院。所有細胞置于含有10% FBS 的DMEM 培養基（美國Gibco 公司）中，于37 ℃和5%的CO2條件下培養。

1.3 細胞分組和相應的處理

選取合適的宮頸癌細胞系進行下一步實驗，將處于對數生長期的細胞分為以下七組：空白組（無處理）、pcDNA3.1 組（轉染pcDNA3.1）、pcDNA3.1-PTENP1組（轉染pcDNA3.1-PTENP1）、NC 組（陰性對照，轉染模擬物或抑制劑NC）、miR-3611 抑制劑組（轉染miR-3611 抑制劑）、pcDNA3.1-PTENP1+NC 組（轉染pcDNA3.1-PTENP1 和NC）、pcDNA3.1-PTENP1+miR-3611 mimics 組（轉染pcDNA3.1-PTENP1 和miR-3611模擬物）。其中pcDNA3.1、pcDNA3.1-PTENP1、抑制劑NC、miR-3611 抑制物、NC、miR-3611 模擬物均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。細胞轉染采用Lipofectamine 2000（美國Invitrogen，748253）進行，所有細胞實驗均設置獨立的3 個復孔。

1.4 PTENP1 在細胞中的亞定位檢測

將宮頸癌細胞用PBS 清洗并置于冰上，用500 ml預冷的細胞分餾緩沖液重新懸浮細胞，在冰上溶解10 min。細胞離心5 min（轉速為5 000 r/min，半徑為165 mm），將上清液（細胞質）與沉淀（細胞核）分離，然后進行PTENP1 相對表達量的檢測。

1.5 實時熒光定量PCR 檢測

使用Trizol（美國Invitrogen，1422）試劑提取組織和細胞的總RNA，用AMV 反轉錄酶處理1 μg RNA以獲得cDNA。PCR 引物序列見表1。GAPDH 作為mRNA 相對定量的內參基因，U6 用于細胞核內RNA和miRNA 的內參基因。PCR 擴增的條件如下：94℃預變性5 min，94℃變性40 s，60℃退火40 s，72℃延伸1 min，72℃延伸10 min 的40 個循環。反應體系為20.0 μl，包括TB Green Premix Ex Taq 10.0 μl，正、反向引物分別0.4 μl，ROX Reference Dye（50×）0.4 μl，DNA模板2.0 μl，滅菌水6.8 μl。最后采用2-ΔΔCt方法分析數據。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.6 CCK-8 檢測

將處理后的宮頸癌細胞懸液稀釋后接種于96 孔板，1×103個/孔。分別于培養0、24、48、72、96 h 的孔中加入10 μl 的CCK-8（美國Sigma），然后培養4 h，用酶標儀（美國Bio-Rad，6532）在450 nm 波長下測量光密度（optical density，OD），每個時間點設置獨立的3 個復孔。

1.7 流式細胞儀檢測

將體積為200 μl 的細胞沉淀重懸在100 μl 的結合緩沖液中，加入2 μl 的Annexin-V-FITC（20 μg/ml），并在冰上混合。15 min 后加入300 μl 的PBS。每個樣品在30 min 內加入1 μl PI 后進行上機檢測，每組設置獨立的3 個復孔。

1.8 蛋白質免疫印跡法檢測

使用BCA 試劑盒（武漢博斯特生物技術有限公司，33528）提取并測定各組細胞和組織的蛋白質。分解后的蛋白質被轉移到PVDF 膜上。在室溫下用5%BSA 進行封閉。PTEN 蛋白（1∶1 000，ab43756）、上皮鈣黏素（1∶1 000，ab7486）、波形蛋白（1∶1 000，ab13457）和β-actin（1∶3 000，ab2378）的一抗購買自美國Abcam。加入一抗并在4℃下孵育過夜后，5 min 內用TBST 洗膜3 次，加入相應的二抗[邁特（上海）生物科技有限公司，178263]，在室溫下孵育1 h。使用Bio-Rad成像儀（美國Bio-Rad）來獲得圖像。目標條帶的灰度值由Image J 軟件進行分析。每個測試重復3次。

1.9 免疫熒光染色

采用4%多聚甲醛在室溫下固定30 min 后在室溫下加入0.1%Triton X-100。約10 min 后，加入正常山羊血清后加入上皮鈣黏素和波形蛋白的抗體，在37℃的搖床下孵育2 h 后用PBST 清洗3 次，采用顯微鏡進行觀察拍照。

1.10 雙螢光素酶報告實驗

使用生物信息學軟件（http://www.targetscan.org）來預測PTENP1 和miR-3611 的關系。合成的PTENP1 3’UTR 基因序列通過限制性酶位點Bamh1 和Ecor1將PTENP1 3’UTR 基因序列引入到pMIR-reporter。將確認的野生型和突變型質粒分別與模擬物NC 和miR-3611 模擬物轉染到293 T 細胞。使用生物信息學軟件（http://www.targetscan.org）預測miR-3611 和PTEN 基因3’UTR 的結合部位。構建PTEN 基因3’UTR 野生型質粒，合成PTEN 基因3’UTR 啟動子序列與miR-3611 的結合位點，構建了PTEN 基因3’UTR 突變體質粒。然后將PTEN 基因3’UTR 野生型和PTEN 基因3’UTR 突變型質粒轉染給模擬物NC和miR-3611 模擬物轉入293T 細胞，使用Lipofectamine 2000 調節劑轉染48 h 后使用螢光素酶試劑盒（美國BioVision，BC1573）來檢測螢光素酶的活性。

1.11 RNA 下拉實驗

將總體積為50 nmol/ml 的miR-3611 轉染生物素標記的野生型和50 nmol/ml 的miR-3611 轉染生物素標記的突變型分別轉染到細胞。轉染48 h 后，收獲細胞并用PBS 清洗，然后用細胞裂解緩沖液（美國Ambion，2375）孵育10 min。然后制備50 ml 的細胞裂解液，用M-280 鏈霉菌素預涂的無核糖核酸酶在4℃下孵育3 h 后應用實時熒光定量PCR 檢測PTENP1 的表達。

1.12 統計學方法

采用SPSS 21.0 統計學軟件進行數據分析。計量資料采用均數±標準差（±s）表示，比較采用t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 癌組織與癌旁組織、各個宮頸癌細胞系及不同處理組中PTENP1 的表達量比較

癌組織中PTENP1 相對表達量低于癌旁組織，HeLa、SiHa、C33A、Caski 細胞PTENP1 相對表達量低于H8 細胞（P＜0.05）。選擇宮頸癌細胞系中PTENP1相對表達量最低的Caski 細胞和最高的HeLa 細胞進行后續實驗，PTENP1 在Caski、HeLa 細胞質中高表達。Caski、HeLa 細胞的pcDNA3.1-PTENP1 組PTENP1 相對表達量均高于空白組（P＜0.05）。見圖1。

圖1 癌組織與癌旁組織及各個宮頸癌細胞系中PTENP1 的表達比較（n=3）

2.2 空白組、pcDNA3.1 組、pcDNA3.1-PTENP1 組細胞增殖活力及凋亡率比較

Caski、HeLa 細胞的pcDNA3.1-PTENP1 組增殖活力（培養48、72、96 h）低于空白組，凋亡率高于空白組（P＜0.05）。見圖2。

圖2 空白組、pcDNA3.1 組、pcDNA3.1-PTENP1 組細胞增殖活力及凋亡率比較（n=3）

2.3 空白組、pcDNA3.1 組、pcDNA3.1-PTENP1 組上皮間質轉化相關指標比較

Caski、HeLa 細胞的pcDNA3.1-PTENP1 組ZEB1、Snail mRNA 相對表達量低于空白組，上皮鈣黏素、波形蛋白水平高于空白組（P＜0.05）。見圖3。

圖3 空白組、pcDNA3.1 組、pcDNA3.1-PTENP1 組上皮間質轉化相關指標比較（n=3）

2.4 癌組織與癌旁組織、各個宮頸癌細胞系及不同處理組中miR-3611 的表達比較

癌組織miR-3611 相對表達量高于癌旁組織，HeLa、SiHa、C33A、Caski 細胞miR-3611 相對表達量高于H8 細胞（P＜0.05）。Caski、HeLa 細胞miR-3611 抑制劑組miR-3611 相對表達量低于空白組（P＜0.05）。見圖4。

圖4 癌組織與癌旁組織及各個宮頸癌細胞系中miR-3611 的表達情況（n=3）

2.5 pcDNA3.1-PTENP1+NC 組、pcDNA3.1-PTENP1+miR-3611 mimics 組不同時間點細胞增殖活力及上皮間質轉化相關指標比較

Caski、HeLa 細胞pcDNA3.1-PTENP1+miR-3611 mimics 組細胞增殖活力（培養48、72、96 h）、上皮鈣黏素低于pcDNA3.1-PTENP1+NC 組，ZEB1、Snail mRNA相對表達量及波性蛋白水平高于pcDNA3.1-PTENP1+NC 組（P＜0.05）。見圖5。

圖5 pcDNA3.1-PTENP1+NC 組、pcDNA3.1-PTENP1+miR-3611 mimics 組不同時間點細胞增殖活力及上皮間質轉化相關指標比較（n=3）

2.6 癌組織與癌旁組織、各個宮頸癌細胞系及不同處理組中PTEN 基因及其蛋白的表達比較

癌組織中PTEN 基因及其蛋白低于癌旁組織，HeLa、SiHa、C33A、Caski 細胞PTEN 基因及其蛋白低于H8 細胞（P＜0.05）。Caski、HeLa 細胞的pcDNA3.1-PTENP1組PTEN 基因高于空白組，miR-3611 抑制劑組PTEN 基因高于空白組（P＜0.05）。見圖6。

圖6 癌組織與癌旁組織、各個宮頸癌細胞系及不同處理組的PTEN 基因及其蛋白的表達比較（n=3）

2.7 PTENP1 與miR-3611 及PTEN 的靶向關系驗證

Caski、HeLa 細胞pcDNA3.1-PTENP1 組miR-3611相對表達量高于空白組，miR-3611 抑制劑組PTENP1相對表達量高于空白組（P＜0.05）。野生型miR-3611轉染生物素標記的Caski、HeLa 細胞的PTENP1 相對表達量高于轉染生物素標記的空白細胞和突變型miR-3611 轉染生物素標記的細胞，分別轉染PTENP1或PTEN 基因野生型和miR-3611 模擬物的293T 細胞的相對螢光活性低于僅轉染PTENP1 或PTEN 基因野生型的293T 細胞（P＜0.05）。見圖7。

圖7 PTENP1 與miR-3611 及PTEN 的靶向關系驗證（n=3）

3 討論

目前研究表明，ceRNA 調控網絡參與了各種生物活動，如調節癌癥發生和發展的基因表達[15]。本研究顯示，PTENP1 通過靶向miR-3611 來上調PTEN 基因，以抑制宮頸癌中的細胞增殖并促進上皮間質轉化。miR-3611 是位于人類染色體7 上的DNA 復制基因MCM7 的第13 個內含子[16]。既往研究顯示，miR-3611在腫瘤發生中的作用與PTEN 基因腫瘤通路和TGF-β 信號通路相關[17-19]。本研究中的雙螢光素酶報告基因測定驗證了miR-3611 與PTEN 基因的靶向關系，進一步RNA 下拉實驗結果也提示PTENP1 和miR-3611 之間的結合關系。

PTEN 基因是PI3K-Akt 信號通路的重要負調節因子，支持PTEN 基因和PTENP1 在調節腫瘤進展中細胞凋亡。此外，上皮間質轉化被認為是腫瘤細胞侵襲和轉移的最重要機制之一，其中上皮細胞具有間充質和成纖維細胞樣特性[20-24]。先前研究表明，PTEN 基因缺失或PI3K/Akt 信號通路激活可促進前列腺癌細胞的上皮間質轉化和腫瘤進展，本研究與這一觀察結果一致[25]。盡管本研究已經在細胞實驗對這一結論進行探究，但目前仍然缺少必要的動物及深入的臨床數據對這一分子機制進行驗證。因此這也是未來的主要研究方向。

綜上所述，本研究闡明了PTENP1 與miR-3611競爭性結合以調節PTEN 基因表達影響宮頸癌進程，以上結果為宮頸癌的靶向治療及早期診斷提供了理論支持。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。