骨痹通消顆粒對激素型股骨頭壞死人骨髓間充質干細胞成骨與成脂分化的影響

王壯壯 周正新 朱 磊 朱彩玉 顧一帆 李子鵬 陳少奇李 勝

1.安徽中醫藥大學第一臨床醫學院，安徽合肥 230031；2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院骨傷二科，安徽合肥 230031

股骨頭壞死是由各種原因導致股骨頭血運受阻及骨細胞數量減少的一種骨關節疾病[1]。糖皮質激素（glucocorticoid，GC）在近些年應用廣泛，導致激素性股骨頭壞死（steroid-induced avascular necrosis of the femoral head，SANFH）患者日益增多[2]。醫學界各大學者從未停止過對此病的深入研究，但仍有很多病理學及病因在臨床尚未得到充分驗證[3]。人骨髓間充質干細胞（human bone marrow mesenchymal stem cell，hBMMSC）是一種能夠分化為成骨細胞、脂肪細胞等多種細胞的成體干細胞[4]。研究表明，使用過量激素可能會造成hBMMSC 成骨/成脂分化功能紊亂，使骨組織的修復再造受阻[5]。而SANFH 的發病與hBMMSC分化異常密切相關。因此，調控hBMMSC分化對于治療SANFH 至關重要。中藥骨痹通消顆粒是由安徽中醫藥大學第一附屬醫院著名骨科專家丁鍔教授的經驗方化裁而來，前期基礎研究表明，該方能夠抑制糖皮質激素對骨細胞與成骨細胞的破壞[6-7]。為此，本研究通過提取hBMMSC進行實驗分析，探討骨痹通消顆粒對hBMMSC成骨和成脂分化的影響，進一步為骨痹通消顆粒治療SANFH 奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物及細胞 30 只清潔級新西蘭白兔，體重3.0～3.5 kg，采購于安徽省動物實驗中心[許可證號SCXK（皖）2020-001，合格證號：NO.202213656]，嚴格遵守動物倫理學進行飼養（AHUCM-rabbits-2022023）。骨髓取自2021 年9 月至2022 年9 月安徽中醫藥大學第一附屬醫院10 例骨傷科SANFH 并行手術患者，用于體外培養hBMMSC?；颊咂骄挲g（52.83±8.55）歲。本研究方案已獲得安徽中醫藥大學第一附屬醫院醫學倫理委員會批準（2022AH-81）。

1.1.2 實驗藥物 骨痹通消顆粒（赤芍12 g、丹參15 g、續斷10 g、川芎10 g、淫羊藿10 g、當歸10 g、甘草6 g、土鱉蟲6 g、肉桂4 g）是安徽中醫藥大學第一附屬醫院院內制劑，由該院中藥房制作、采購，注射用地塞米松磷酸鈉（5 mg/支，馬鞍山豐原制藥有限公司）。

1.1.3 主要試劑和儀器 茜素紅染色液（上海碧云天生物技術有限公司，批號：C0140）；油紅O 染液（北京索萊寶科技有限公司，批號：G1262）；成骨與成脂誘導分化試劑盒（加拿大STEMCELL 公司，批號：2320036、2320056）；CCK-8 試劑盒（上海奕杉生物科技有限公司，批號：100-106）；RNA 提取試劑盒（廣州美基生物，批號：RJH19-01）；反轉錄試劑盒[新貝（上海）生物科技有限公司，批號：R202-02]；BMP-2、Runx2、βcatenin、PPARγ、C/EBP-α 及Fabp4 抗體均購自Bioss公司（批號：AB11286487、AB09245415、AB10163878、AB178860、AB40764、AB32552）；二抗羊抗兔IgG（武漢博士德生物工程有限公司，批號：BST16D22C16C54）。

1.2 實驗方法

1.2.1 含藥血清制備 20 只大白兔適應性飼養1 周后，按照人與兔的體重計算等效劑量[8]，給予骨痹通消顆粒（4.5 g/kg）灌胃，每天2 次，灌胃7 d 后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉（45 mg/kg）進行麻醉，進而心臟采血并無菌分離含藥血清，分裝后貯存在-20 ℃冰箱備用。動物尸體由安徽中醫藥大學實驗動物中心統一處理。

1.2.2 hBMMSC 分離、培養及鑒定 在患者行全髖關節置換術時，用5 ml 注射器從股骨中抽取1～2 ml 骨髓液，加入完培培養基培養，每隔2 d 換液1 次，當細胞密度達到80%～90%時，消化并傳代細胞繼續培養。取第三代細胞在顯微鏡下觀察細胞形態學，并分別進行成骨和成脂誘導培養。每隔3 d 換液1 次，21 d 后進行茜素紅染色、油紅O 染色，顯微鏡下觀察胞髓系分化潛能。

1.2.3 CCK-8 檢測細胞增殖 將第三代細胞以1×104/孔均勻鋪在96 孔板上，并分為完培組（基礎培養基+10%的胎牛血清）及1%、2%、5%、8%、10%體積分數的含藥血清A 組，每組10 個復孔，培養24 h 后，每孔加入CCK-8 溶液10 μl，孵育1 h，在酶標儀上以450 nm 的波長檢測各組的光密度（optical density，OD）值。為了進一步探究骨痹通消顆粒對GCs 環境下hBMMSC 細胞活力的影響，繼續種細胞于96 孔板，細胞貼壁后，每孔加入0.52 μl 地塞米松溶液，分為損傷組（基礎培養基+10%的胎牛血清+0.52 μl 地塞米松溶液）與含藥血清B 組（分別為基礎培養基+2%、5%、8%含藥血清+0.52 μl 地塞米松溶液），同時制備完培組（基礎培養基+10%的胎牛血清）。每組10 個復孔。培養24 h 后，按照CCK-8 試劑盒測定各孔波長450 nm 處的OD 值。

1.2.4 實驗分組 基于“1.2.3”的實驗結果重新分組為對照組、模型組、實驗組。無激素誘導細胞作為對照組（基礎培養基+10%的胎牛血清）。參考文獻[9]中方法，使用地塞米松（10-5mol/L）溶液誘導細胞損傷，隨后將體外激素誘導的hBMMSC 細胞分為模型組（基礎培養基+10%的胎牛血清+10-5mol/L 地塞米松溶液）、實驗組（基礎培養基+5%的骨痹通消含藥血清+10-5mol/L地塞米松溶液）。

1.2.5 hBMMSC 成骨分化 調整細胞密度為5×104/ml，鋪在6 孔板上，按“1.2.4”項下分組，每組3 個復孔。分別給予各組含相應血清的hBMMSC 成骨誘導分化培養基培養，每隔3 d 更換1 次培養基。21 d 后按照成骨染色試劑盒染色后在顯微鏡下觀察。

1.2.6 hBMMSC 成脂分化 調整細胞密度為5×104/ml，鋪于6 孔板，按“1.2.4”項下分組，每組3 個復孔。分別給予各組含相應血清的hBMMSC 成脂誘導分化培養基培養，每隔3 d 更換1 次培養基。21 d 后按照成脂染色試劑盒染色后在顯微鏡下觀察。

1.2.7 RT-qPCR 檢測hBMMSC 中成脂相關基因的表達 選取PPARγ、C/EBP-α 及Fabp4 作為目標檢測基因，β-actin 為內參。按照試劑盒說明書提取細胞中RNA，并檢測其純度。取2 μg 的RNA，按照37 ℃、15 min，85 ℃、5 s 反應程序將RNA 反轉錄為cDNA，于-20℃冰箱保存，加入相應引物和熒光染料擴增，反應體系為50 μl，其中10×PCR Buffer 5 μl,d NTPs 1 μl，正反向引物各1 μl，DNA 模板2 μl，Tap 酶0.5 μl，加雙蒸水至50 μl。反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火及延伸30 s，循環45 次，72 ℃延伸5 min。采用2-ΔΔCt法進行數據分析。引物序列見表1。實驗重復3 次。

表1 各基因引物序列（5’-3’）

1.2.8 Western blot 檢測hBMMSC 中成骨相關蛋白的表達 選取BMP-2、Runx2 及β-catenin 為目標蛋白，β-actin 為內參。使用RIPA 和PMSF 混合而成的裂解液提取各組蛋白，BCA 法測定濃度。依次進行上樣、凝膠電泳、轉膜及封閉，在4 ℃環境下配搖床孵育一抗（1∶1 000）過夜。TBST 洗膜3 次，室溫孵育對應的二抗（1∶5 000），采用Image J 軟件分析條帶。并計算目標蛋白相對表達量。實驗重復3 次。

1.3 統計學方法

采用SPSS 23.0 統計學軟件進行數據分析。計量資料采用均數±標準差（±s）表示，比較采用t 檢驗；計數資料采用例數或百分率表示，比較采用χ2檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 hBMMSC 的形態學及髓系分化潛能鑒定

將抽提的骨髓接種后，顯微鏡下觀察顯示，原代細胞呈圓形或其他不規則形狀，7 d 后，可見梭形、紡錘形或多角形的貼壁細胞（圖1A）。第三代細胞生長均勻，平行排列，透光率好（圖1B）。成骨誘導21 d，細胞發生改變，局部細胞聚集，并有礦化結節產生，茜素紅染色呈陽性（圖1C）；成脂誘導21 d，脂滴與油紅O染液結合變為紅色，油紅O 染色呈陽性（圖1D）。

圖1 細胞形態學觀察及髓系分化（40×）

2.2 骨痹通消顆粒降低GCs 對hBMMSC 細胞活力的影響

與完培組比較，10%體積分數的含藥血清A 組細胞活力下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。與完培組比較，損傷組細胞活力下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；與損傷組比較，2%、5%、8%體積分數的含藥血清B 組可細胞活力升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。5%體積分數的含藥血清B 組細胞活力高于2%、8%體積分數的含藥血清B 組。見圖2～3。

圖2 不同體積分數的骨痹通消含藥血清作用24 h 后對細胞增殖的影響（n=10）

圖3 不同體積分數的骨痹通消含藥血清對激素環境中細胞活力的影響（n=10）

2.3 各組成骨分化情況

與對照組比較，模型組染色面積降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，實驗組中礦化結節與沉積升高，染色范圍也更廣，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖4、表2。

圖4 各組茜素紅染色情況（40×）

表2 各組細胞鈣化結節數（±s）

表2 各組細胞鈣化結節數（±s）

注與對照組比較，aaP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05。

2.4 各組成脂分化情況

與對照組比較，模型組細胞內脂質積累增多，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，實驗組較細胞內脂質積累降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖5、表3。

圖5 各組油紅O 染色情況（40×）

表3 各組細胞脂滴數（±s）

表3 各組細胞脂滴數（±s）

注與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05。

2.5 各組成脂相關基因表達

與對照組比較，模型組PPARγ、C/EBP-α 和Fabp4的表達量升高，差異有高度統計學意義（P＜0.01），與模型組比較，實驗組PPARγ、C/EBP-α 和Fabp4 的表達量降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖6。

圖6 各組細胞基因表達情況（n=3）

2.6 各組成骨相關蛋白表達。

與對照組比較，模型組BMP-2、Runx2 及β-catenin蛋白表達含量升高，差異有高度統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，實驗組BMP-2、Runx2 及β-catenin 蛋白表達含量降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖7～8。

圖7 各組成骨蛋白條帶圖

圖8 各組蛋白的相對表達量（n=3）

3 討論

SANFH 的發病機制有很多，如成骨成脂分化失衡、脂肪栓塞、骨質疏松、細胞凋亡與功能失衡，以及凝血異常等[10-12]。hBMMSC 成骨成脂分化的失衡是最主要的發病機制之一。當脂肪細胞增多，容易引起凝血障礙，導致細胞凋亡與功能失衡，繼而導致股骨頭骨髓壞死的惡性循環[13]。該病在中醫上為“骨蝕”范疇。《素問·痹論》篇曰：“風、寒、濕三氣雜至合，病在骨，骨髓酸痛，而為骨蝕。”發病根本在于腎虛，與脾腎密切相關，脾腎兩虛導致痰結血瘀，不通則痛，不榮則痛，而疼痛是SANFH 最明顯的臨床特征[14-15]。大量研究數據表明，補腎壯陽、活血化瘀類方藥對激素性股骨頭壞死具有一定的治療效果[16-18]。骨痹通消顆粒選用有強筋健骨之功的淫羊藿、續斷、土鱉蟲與活血化瘀止痛作用的丹參、赤芍、川芎、當歸及引火歸元的肉桂，加以甘草調和諸藥，共奏補腎活血化瘀之功[19]。hBMMSC 在疾病的發展過程中至關重要，成骨-成脂分化在生理狀態下處于動態平衡狀態，若長期使用大量糖皮質激素會打破這種平衡，導致二者分化出現異常，進而引起SANFH 等相關疾病[20-21]。因此，對于改善成骨-成脂的分化比例，延緩SANFH 的進程有重大意義。本研究于體外分離hBMMSC，加以骨痹通消顆粒含藥血清培養，觀察其對hBMMSC 增殖及成骨、成脂分化的影響，明確骨痹通消顆粒發揮作用的機制。

茜素紅染色能夠反映成骨分化晚期鈣化結節的數量。本研究表明，骨痹通消顆粒含藥血清能夠促進hBMMSC 鈣化并減少細胞中脂質生成，抑制其成脂分化的能力。hBMMSC 的分化由許多轉錄因子調控。Runx2 是一種hBMMSC 向成骨細胞分化的不可或缺的轉錄因子，且可抑制hBMMSC 成脂分化[22]。BMP-2能夠促進hBMMSC 分化為成骨細胞[23]。β-catenin 作為Wnt/β-catenin 的通路蛋白，能夠激活該通路來促進hBMMSC 向成骨分化。PPARγ 對Runx2 有負向調節作用。在hBMMSC 成骨與成脂分化時，Runx2 和PPARγ 共同調控各種細胞因子以維持平衡，GCs 能夠通過下調Runx2 的表達抑制hBMMSC 的成骨分化作用，通過上調PPARγ 的表達促進其向成脂分化[24]。C/EBP-α 與Fabp4 同樣為hBMMSC 在脂肪分化過程中的關鍵基因，能夠與PPARγ 共同調控成脂相關蛋白[25]。本研究發現，骨痹通消顆粒能夠促進hBMMSC 中成骨相關蛋白BMP-2、Runx2 及β-catenin的表達，且可下調成脂相關基因PPARγ、C/EBP-α 和Fabp4 中mRNA 的表達，進一步證明骨痹通消顆粒含藥血清促進成骨分化、抑制成脂分化的藥效作用。

綜上所述，骨痹通消顆粒能夠促進hBMMSC 成骨分化的能力，并抑制其向成脂分化，進一步調控hBMMSC 成骨-成脂分化的平衡與穩態，起到防治激素性股骨頭壞死的作用。為了更好地發揮骨痹通消顆粒的功效，還需更多臨床及動物實驗進一步探究其對SANFH 的防治優勢。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。