七種不同基質(zhì)金屬蛋白酶在抗結(jié)核藥物性肝損傷小鼠模型中的表達(dá)與臨床價(jià)值

陸霓虹 杜映榮 劉洪璐 陳楊君 楊永銳

昆明市第三人民醫(yī)院云南省傳染性疾病臨床醫(yī)學(xué)中心，云南昆明 650041

抗結(jié)核藥物性肝損傷（anti-tuberculosis druginduced liver injury，ATB-DILI）發(fā)病率較高，影響抗結(jié)核治療效果[1-4]。因?yàn)锳TB-DILI 致病因素復(fù)雜，缺乏有效防治措施及方法[5]。肺結(jié)核患者在治療過程中常出現(xiàn)保肝藥物的濫用和不必要聯(lián)用，如何早期識(shí)別肝損傷是疾病防控重點(diǎn)。此外，臨床缺乏肝功能預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)早期預(yù)測(cè)肝損傷程度及預(yù)后的指標(biāo)具有重要意義。

基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）與多種炎癥進(jìn)程相關(guān)，不同亞型的MMP（MMP-2、9、14等）在炎癥環(huán)境下促進(jìn)細(xì)胞自噬，導(dǎo)致肝細(xì)胞的損傷和死亡，但罕見MMP 在ATB-DILI 中的相關(guān)報(bào)道[6]。團(tuán)隊(duì)前期發(fā)現(xiàn)ATB-DILI 患者血清MMP-9、14 表達(dá)上調(diào)[7-8]。本研究通過分析ATB-DILI 動(dòng)物模型中MMP 的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)影響ATB-DILI 的因素，為探究ATB-DILI預(yù)測(cè)指標(biāo)奠定動(dòng)物模型基礎(chǔ)。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

120 只雄性昆明種（KM）小鼠，SPF 級(jí)，6 周齡，體重18～24 g，由中國科學(xué)院昆明動(dòng)物所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：YNXY（滇）-2019-22，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCKK（粵）2020-0053。小鼠飼養(yǎng)于中國科學(xué)院昆明動(dòng)物所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障系統(tǒng)，合格證號(hào)：（昆）-2019-103。飼養(yǎng)條件一致，室溫21～26 ℃，濕度55%～65%，明暗各12 h。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1 主要儀器 SPECTCA MAX190 酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices 公司）、4 ℃/-20 ℃電冰箱（青島海爾國際貿(mào)易有限公司）、ST8R 高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo Scientific 公司）等。

1.2.2 使用藥物 成都錦華藥業(yè)有限公司異煙肼片（isoniazid，INH，0.1 g/片，批號(hào)：230815）、利福平膠囊（rifampicin，RIF，0.15 g/粒，批號(hào)：J2523011）、鹽酸乙胺丁醇片（ethambutol hydrochloride，EB，0.25 g/片，批號(hào)：T23N003）、吡嗪酰胺片（pyrazinamide，PZA，0.25 g/片，批號(hào)：23070）。根據(jù)動(dòng)物與人體重劑量折算系數(shù)，得出小鼠藥物給藥劑量[9]。INH 45 mg/（kg·d）、RIF 90 mg/（kg·d）、EB 135 mg/（kg·d），吡嗪酰胺（pyrazinamide，PZA）180 mg/（kg·d）。用0.5%羧甲基纖維素配成所需濃度的混懸液備用。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)試劑 MMP-1、2、3、7、9、13、14 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法試劑盒（貨號(hào)：KE10033、34、35、36、37、38、39），購自美國Proteintech 公司。牛分枝桿菌減毒株卡介苗（BacillusCalmette-Guérin，BCG，試劑號(hào)：S20123007，成都生物制品研究所）。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理

120 只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后隨機(jī)選100 只BCG 滴鼻，1 周后取肺組織采用PCR 檢測(cè)BCG、菌落培養(yǎng)證實(shí)感染結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB），建立感染MTB 的小鼠模型。將小鼠隨機(jī)區(qū)組法分為5 組，每組20 只，各組體重均衡。①INH組灌胃INH 45 mg/（kg·d）；②RIF 組，灌胃RIF 90 mg/（kg·d）；③EB 組，灌胃EB 135 mg/（kg·d）；④PZA 組，灌胃PZA 180 mg/（kg·d）；⑤四聯(lián)藥物組，灌胃四聯(lián)混合藥（INH 45 mg+RIF 90 mg+EB 135 mg+PZA 180 mg）/（kg·d）。另外20 只未感染MTB 的小鼠設(shè)為對(duì)照組，灌胃PBS。所有小鼠每天空腹灌胃1 次，各組分別于灌胃12 h，1、2、3 周后處死5 只小鼠。處死前稱重，斷頭取血，肝臟病理切片出現(xiàn)肝損傷，證實(shí)建模成功[10]。本研究經(jīng)昆明市第三人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批同意（201902312）。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

EDTA 抗凝小鼠血，離心機(jī)4 ℃，3 500 r/min，離心20 min，離心半徑16.80 cm，取上清置于-20℃保存。按照試劑盒說明操作，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)MMP-1、2、3、7、9、13、14 表達(dá)。小鼠肝稱濕重，肝臟指數(shù)=肝臟濕質(zhì)量（g）/小鼠體質(zhì)量（g）×100%[11]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析，比較采用SNK-q 檢驗(yàn)，相關(guān)分析用Pearson 檢驗(yàn)。不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（P25，P75）]表示，比較采用Kruskal-Wallis H 秩和檢驗(yàn)，總體差異用Kruskal-Wallis 單因素ANOVA（k 樣本）檢驗(yàn)，相關(guān)分析用Spearman 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗結(jié)核藥對(duì)小鼠的一般狀況影響

對(duì)照組小鼠體重逐步增加，活動(dòng)正常。給藥小鼠精神萎靡，不愿活動(dòng)。隨給藥時(shí)間延長(zhǎng)，小鼠皮毛顏色暗淡，活動(dòng)少，進(jìn)食少，體重增加較正常對(duì)照組少。見圖1。

圖1 灌胃不同藥物3 周小鼠體重變化（n=20）

2.2 各組給藥12 h 小鼠血清MMP-1、2、3、7、9、13、14表達(dá)水平及肝臟指數(shù)比較

給藥12 h，與對(duì)照組比較，RIF 組MMP-7 表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各組MMP-1、2、3、9、13、14 表達(dá)和肝臟指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組給藥12 h 小鼠血清MMP-1、2、3、7、9、13、14 表達(dá)水平及肝臟指數(shù)比較（n=5）

2.3 各組連續(xù)灌胃1 周小鼠血清MMP-1、2、3、7、9、13、14 表達(dá)水平及肝臟指數(shù)比較

連續(xù)灌胃1 周，與對(duì)照組比較，INH、RIF 和四聯(lián)藥組小鼠MMP-2 和MMP-7 表達(dá)上調(diào)，肝臟指數(shù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；各組MMP-1、3、9、13、14 表達(dá)和肝臟指數(shù)與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組連續(xù)灌胃1 周小鼠血清MMP-1、2、3、7、9、13、14 表達(dá)水平及肝臟指數(shù)比較（n=5）

2.4 各組連續(xù)灌胃2、3 周小鼠血清MMP-1、2、3、7、9、13、14 表達(dá)水平及肝臟指數(shù)比較

連續(xù)灌胃藥物2、3 周后，與對(duì)照組比較，RIF、INH、四聯(lián)藥組小鼠血清MMP-2、7、9 表達(dá)上調(diào)，肝臟指數(shù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；各組其他MMP 表達(dá)水平和肝臟指數(shù)與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組連續(xù)灌胃2、3 周小鼠血清MMP-1、2、3、7、9、13、14 表達(dá)水平及肝臟指數(shù)比較（n=5）

2.4 不同抗結(jié)核藥致肝損傷小鼠中MMP-2、7、9 與肝臟指數(shù)的相關(guān)性分析

INH 組MMP-2、7、9 與肝臟指數(shù)無相關(guān)性（r=0.233、0.241、0.215，P＞0.05），四聯(lián)藥組MMP-2、7、9與肝臟指數(shù)無相關(guān)性（r=0.242、0.252、0.273，P＞0.05）。RIF 組MMP-7 與肝臟指數(shù)呈正相關(guān)（r=0.981，P＜0.05）。

3 討論

ATB-DILI 的發(fā)生機(jī)制尚無定論，多種因素如免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等證實(shí)與ATB-DILI 相關(guān)，但ATB-DILI 是否與MMP 家族介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)相關(guān)，尚無研究報(bào)道[12-15]。MMP 是一類廣泛存在于各種組織中的蛋白酶超家族，在細(xì)胞外基質(zhì)的生理性和病理性降解中發(fā)揮重要作用[16]。MMP 主要分為膠原酶、基質(zhì)溶解素、明膠酶等亞家族[17]。許多組織和細(xì)胞均可產(chǎn)生MMP，巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞產(chǎn)生MMP-2、9 作用于血管平滑肌細(xì)胞，MMP-3、7 作用于上皮細(xì)胞，促進(jìn)多種炎癥因子的分泌[18]。

本研究顯示，INH、RIF 與四聯(lián)抗結(jié)核藥組小鼠MMP-2、7、9 在灌胃1～3 周后逐步升高，提示MMP-2、7、9 與抗結(jié)核藥INH、RIF 導(dǎo)致的肝損傷具有相關(guān)性，ATB-DILI 可能為一種炎癥反應(yīng)，并與MMP 有關(guān)。EB組、PZA 組MMP-1、2、7、9、13、14 表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示MMP-2、7、9介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)主要與INH、RIF 有關(guān)，與EB 與PZA兩種藥物相關(guān)性不大。

MMP-7 是MMP 家族中最小的分子，主要由巨噬細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞分泌，與腫瘤形成、肝纖維化與炎癥壞死密切相關(guān)[19]。本研究顯示MMP-7 在INH、RIF 與四聯(lián)抗結(jié)核藥導(dǎo)致的肝損傷中持續(xù)性升高，提示MMP-7 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是ATB-DILI 發(fā)生的重要因素。MMP-7 能協(xié)同各類炎癥因子促進(jìn)上皮細(xì)胞基質(zhì)降解，細(xì)胞壞死溶解[20]。在炎癥狀態(tài)下MMP-7 還能直接促進(jìn)成纖維細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性，增加MMP-2、9 表達(dá)，促進(jìn)血管增生及肝組織纖維化[21-22]。本研究顯示，肝損傷發(fā)生時(shí)巨噬細(xì)胞增生活躍，MMP-7表達(dá)上升，從而促進(jìn)MMP-2、9 分泌增加，肝損傷加重。這也解釋了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中MMP-7 上升1 周后，MMP-2、9隨后逐步上升，驗(yàn)證了MMP-7 與MMP-2、9 有協(xié)同作用，與文獻(xiàn)報(bào)道吻合[23]。

綜上，MMP-2、7、9 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)與抗結(jié)核藥物性肝損傷密切相關(guān)，其中MMP-7 可用于預(yù)判抗結(jié)核藥物性肝損傷嚴(yán)重程度。通過進(jìn)一步研究MMP-2、7、9 的上游通路，發(fā)現(xiàn)下游因子并進(jìn)行阻斷，可能對(duì)防治ATB-DILI 具有一定臨床價(jià)值。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。