微RNA-296、血管內皮生長因子-B 的表達與冠心病患者冠脈病變程度的關系

李 震 郝恩剛 劉丹青

1.山東省聊城市第二人民醫院檢驗科，山東臨清 252600；2.山東省聊城市第二人民醫院心內科，山東臨清 252600；3.山東省臨清市人民醫院檢驗科，山東臨清 252600

冠心病（coronary heart disease，CHD）是心血管系統常見疾病，近年來CHD 發病率在全球范圍內上升，已成為我國乃至全球人類死亡的最常見因素之一[1-3]。冠狀動脈狹窄（coronary artery stenosis，CAS）程度對CHD 患者選擇最佳治療方案至關重要，并與心血管風險分層密切相關[4]。因此，需要一個潛在而有效的生物標志物來評估CHD 患者的CAS 程度。研究表明，動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）參與CHD 發生、發展[5]。微RNA（microRNA，miRNA）是一種長度為19～24 個核苷酸的單鏈非編碼RNA，能通過調控多種機制參與CHD 過程[6]。miR-296 被報道在CHD 個體中差異表達[7]。過表達miR-296 能促進心肌細胞增殖，改善心肌梗死后心功能[8]。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是血管生成的重要介質，能通過炎癥反應促進AS 發生、發展[9]。但有關miR-296、VEGF-B 與CHD 患者CAS 程度的相關性報道有限。本研究分析CHD 患者miR-296、VEGF-B表達與CAS 的關系，以期為CHD 診治提供一定參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019 年1 月至2022 年11 月山東省聊城市第二人民醫院收治的93 例CHD 患者，其中，女40例，男53 例；年齡42～73 歲，平均（56.71±6.50）歲；體重指數18.71～31.49 kg/m2，平均（23.94±2.63）kg/m2。納入標準：①符合《臨床冠心病診斷與治療指南》[10]CHD診斷標準；②初次確診，入院前未接受相關治療。排除標準：①冠狀動脈造影禁忌證；②既往冠狀動脈介入治療史；③先天性心臟病；④妊娠期或哺乳期；⑤合并其他心肌病；⑥血液、免疫、神經系統疾病，惡性腫瘤；⑦嚴重肝、腎功能障礙；⑧近1 個月內急慢性感染。本研究經山東省聊城市第二人民醫院倫理委員會批準（【2023】醫倫審第（04）號）。

1.2 研究方法

1.2.1 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,Rt-PCR） 采集CHD 組空腹靜脈血6 ml，其中3 ml 血液抗凝后使用TRIzol 試劑（賽默飛世爾科技公司，編號：15596018CN）提取全血總RNA，TaKaRa PrimeScrip RT 試劑盒[寶日醫生物技術（北京）有限公司，編號：RR037A]合成cDNA。按照Cham QTMunivers SYBR qPCR Master Mix（Vazyme）試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，編號：Q111-02）說明書進行RT-PCR。反應體系：互補DNA 1 μl、2×HieffRobust PCR Master Mix 10 μl、正反向引物各2.5μl，ddH2O 加至總體積25 μl；反應條件：95 ℃90 s、95 ℃30 s、63 ℃30 s、72 ℃15 s，循環40 次后收集Ct 值，miR-296 以U6 為內參校正，2-ΔΔCt法計算miR-296相對表達量。miR-296：正向引物：5’-GGGGGGGAGGCCCCGA-3’，反向引物：5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’；U6：正向引物：5’-ACACGCACAAACGAGAAAGG-3’，反向引物：5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’。剩余3 ml 血液1 500 g 離心15 min 分離血清，保存于-80 ℃冰箱。采用酶聯免疫吸附試驗試劑盒（上海烜雅生物科技有限公司，編號：XY0196A）檢測VEGF-B 水平。

1.2.2 結合位點預測與雙螢光素酶報告實驗 經Star-Base、TargetScan、miRWalk 數據庫預測miR-296 與VEGF-B 的結合位點。構建野生型miR-296（miR-296-wild type，miR-296-wt）、野生型VEGF-B（VEGF-B-wild type，VEGF-B-wt）和突變型miR-296（miR-296-mutant，miR-296-mut）、突變型VEGF-B（VEGF-B-mutant，VEGF-B-mut）螢光素酶載體，接下來將載體共轉染至H9C2 細胞中。轉染48 h 后使用雙螢光素酶測定法測定螢光素酶活性。

1.2.3 冠狀動脈造影 所有研究對象入院后均進行冠狀動脈造影（荷蘭飛利浦血管造影機，型號：FD20），記錄病變支數，參考Gensini 積分評估CAS 程度，每處冠脈病變積分為狹窄程度[狹窄直徑＜25%（1 分）、25%～＜50%（2 分）、50%～＜75%（4 分）、75%～＜90%（8 分）、90%～＜99%（16 分）、≥99%（32分）]×冠脈分支（右冠近、中、遠段和后降支均×1；后側支×0.5；遠段和后降支×1；左回旋支近段×2.5；第一對角支×1；第二對角支×0.5），總分為所有病變積分之和[11]。由2 名專業造影診斷醫生獨立評分，取一致結果。根據病變支數將CHD 患者分為單支病變組38 例、雙支病變組33 例、多支病變組22 例。根據Gensini 積分將CHD 患者分為輕度CAS 組（＜30 分，30 例）、中度CAS 組（31～60 分，34 例）、重度CAS 組（＞60 分，29例）。

1.4 統計學方法

采用SPSS 28.0 統計學軟件進行數據分析。計量資料符合正態分布采用均數±標準差（）表示，兩組比較采用t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較LSD-t 檢驗，計量資料不符合正態分布采用中位數（四分位數）[M（P25，P75）]表示，比較采用非參數檢驗；計數資料采用例數或百分率表示，比較采用χ2檢驗。相關性采用Pearson 相關系數或Spearman 相關系數。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同CAS 程度CHD 患者臨床基線特征比較

不同CAS 程度CHD 患者臨床基線特征比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 不同CAS 程度CHD 患者臨床基線特征比較

2.2 不同冠狀動脈病變支數CHD 患者臨床基線特征比較

不同冠狀動脈病變支數CHD 患者臨床基線特征比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 不同冠狀動脈病變支數CHD 患者臨床基線特征比較

2.3 不同CAS 程度CHD 患者miR-296、VEGF-B 表達比較

重度組miR-296 表達低于輕度組和中度組，VEGF-B 水平高于輕度組和中度組，且中度組miR-296 表達低于輕度組，VEGF-B 水平高于輕度組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 不同CAS 程度CHD 患者miR-296、VEGF-B 表達比較

2.4 不同冠狀動脈病變支數CHD 患者血miR-296、VEGF-B 表達比較

多支病變組miR-296 表達低于單支病變組和雙支病變組，VEGF-B 水平高于單支病變組和雙支病變組，且雙支病變組miR-296 表達低于單支病變組，VEGF-B水平高于單支病變組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 不同冠狀動脈病變支數CHD 患者miR-296、VEGF-B 表達比較

2.5 CHD 患者miR-296、VEGF-B 表達與Gensini 積分的相關性

miR-296與VEGF-B存在結合位點（圖1）。與VEGFB-wt 和mir-NC 共轉染至H9C2 細胞比較，VEGFB-wt 和miR-296 共轉染至H9C2 細胞的螢光素酶活性降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。但VEGF-Bwt 和miR-296 共轉染至H9C2 細胞的螢光素酶活性與VEGF-B-wt 和miR-NC 共轉染至H9C2 細胞比較無下降，差異無統計學意義（P＞0.05）（圖2）。Pearson相關性分析顯示，CHD 患者miR-296 與VEGF-B 表達呈負相關（r=-0.731，P＜0.001）。Spearman 相關性分析顯示，CHD 患者miR-296 表達與Gensini 積分及病變支數呈負相關（rs=-0.719、0.638，P＜0.001），VEGF-B表達與Gensini 積分及病變支數呈正相關（rs=0.727、0.698，P＜0.001）。

圖1 miR-296 與VEGF-B 的結合位點圖

圖2 miR-296、VEGF-B 的熒光素酶活性

3 討論

CHD 的特征是在病變的血管中形成的阻塞的富含脂質的斑塊可導致血管腔狹窄或阻塞，導致包括心絞痛和心肌梗死在內的缺血性心臟疾病[12-13]。雖然近年來隨著區域協同救治體系的逐漸完善，以及藥物與非藥物治療手段不斷進展，CHD 患者殘疾和死亡風險大幅度較低，但CHD 患者總體預后仍然較差[4，14]。因此早期準確評估CHD 患者CAS 程度，對選擇合理的治療方案和改善患者預后具有重要意義。

AS 是CHD 發生、發展的病理基礎，其病理生理過程涉及血脂代謝紊亂、炎癥反應、氧化應激、血管內皮損害等多種機制[5]。miRNA 能通過引發信使核糖核酸的降解或轉錄后的基因沉默，通過調節血脂代謝、炎癥反應、氧化應激、血管內皮損害等機制參與AS發生、發展[15]。miR-296 定位于人染色體20q13.32，研究報道，下調miR-296 能靶向基質金屬蛋白酶15 抑制類風濕關節炎大鼠炎癥反應[16]；Pan 等[17]研究報道，敲低miR-296 能靶向S100 鈣結合蛋白A4 抑制深靜脈血栓形成小鼠氧化應激，促進血栓形成。下調miR-296 能靶向缺口受體1 加重中動脈閉塞大鼠血管內皮損傷[18]。重要的是Dai 等[19]研究指出，miR-296降低是冠狀動脈疾病患者行經皮冠狀動脈介入治療后支架內再狹窄的獨立危險因素。基于此，筆者推測miR-296 可能參與AS 過程。本研究結果顯示，CHD患者血miR-296 表達降低，這與Miao 等[7]報道結果相符。結果還顯示，CHD 患者miR-296 表達隨著CAS程度加重和病變支數增加而降低，說明miR-296 低表達與CHD 患者CAS 加重密切相關，分析原因可能是miR-296 低表達可能導致炎癥反應、氧化應激、血管內皮損害，促進AS 發展，進而加重CAS。實驗也報道，上調miR-296 能抑制血管內皮損傷，進而抑制AS發生、發展[20]。

VEGF 是血管內皮特異性生長因子，在炎癥反應等損傷血管內皮細胞時被大量釋放，同時VEGF 也能結合VEGF 受體激活核因子κB 信號通路促進炎癥反應，導致血管內皮損傷加重[21]。VEGF-B 是VEGF 家族重要成員，主要表達于冠狀動脈內皮細胞、平滑肌細胞和心肌等心血管系統，不僅能結合VEGF 受體1 發揮作用，還能與VEGF-A 協同作用，共同加重血管內皮損害，促進AS 發生、發展[22-23]。近年來多項試驗均表明，抑制VEGF 能改善血管內皮損傷，抑制AS進展[24-25]。本研究結果顯示，CHD 患者血清VEGF-B表達上調，并隨著CAS 程度加重和病變支數增加而升高，提示VEGF-B 高表達與CHD 患者CAS 加重密切相關，分析原因可能是VEGF-B 高表達反映血管內皮損傷加重，導致AS 持續進展，進而導致CAS 加重[24]。既往有研究報道，miR-296 高表達能下調VEGF，減少肝細胞癌淋巴管生成[26]；miR-296-5p 表達增強可降低糖尿病視網膜病變小鼠VEGF 表達[27]。本研究通過數據庫預測發現，miR-296 與VEGF-B 存在結合位點，進一步研究發現，VEGF-B 是miR-296 的靶點，且二者在CHD 患者血清中表達呈負相關，提示miR-296與VEGF-B 可能共同影響CHD 患者CAS 程度。因此筆者推測miR-296 表達下調可能引起VEGF-B 表達上調，通過炎癥反應、氧化應激等引起血管內皮損傷，導致CAS 加重。

綜上所述，CHD 患者血miR-296 表達降低，VEGF-B 升高，二者可能共同影響CAS 病變程度。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。