高脂血癥大鼠前列腺增生模型的建立

郭喜平 王旭昀 盧冬冬 俎亞杰 張耀圣

1.北京中醫藥大學東直門醫院泌尿外科，北京 100700；2.首都醫科大學附屬北京中醫醫院男科，北京 100010；3.天津中醫藥大學第一附屬醫院兒科，天津 300192

良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）是由腺體和基質成分的細胞增生引起的前列腺非惡性腫大[1]。本病是中老年男性常見病、多發病，且社會年齡構成逐漸偏向老齡化，生活、飲食、環境等的改變，其相應的發病率和患病率也在迅速增加[2]。目前BPH 的發病機制包括生長因子學說、上皮-間質細胞相互作用學說、激素內分泌學說和最終細胞凋亡學說等[3]。隨著對BPH 研究的不斷深入，臨床觀察發現BPH 和高脂血癥（hyperlipidemia，HLP）往往相伴而生，HLP 是BPH 發病中重要一環[4-5]。臨床中發現HLP 組發生BPH 的風險顯著高于非高脂血癥組[6]。BPH 患者隨著HLP 病程延長、病情加重，其癥狀也隨之加重。目前BPH 與HLP 二者關系多基于臨床研究推測[7-8]。本實驗擬構建HLP 大鼠前列腺增生模型，檢測血清中血脂四項、炎癥因子指標及前列腺組織病理情況，探討高脂血癥大鼠前列腺增生病理狀態，為二者關系研究提供實驗方面理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與飼料

3 月齡健康SPF 級SD 雄性大鼠20 只（體重180～200 g），購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物合格證編號：110322230100713841。動物許可證號：SCXK（京）2019-0008。醫學實驗動物倫理批準文號：MDL2023-03-10-02。普通飼料由康泰醫學檢驗服務河北有限公司提供。高脂飼料為自制（飼料組成：普通飼料63%，豬油20%，蛋黃5%，膽固醇2%）[9]。

1.2 主要儀器及試劑

儀器：離心機（品牌：恒諾儀器，貨號：2-16R）；石蠟病理切片機（品牌：Leica，型號：RM2235）；全自動生化分析儀（品牌：新銳，型號：XR220 Plus）。試劑：血清瘦素（leptin，LEP）、白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-8、前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）ELISA 試劑盒（品牌：CLOUD-CLONE CORP，貨號：SEA019Ra）。

1.3 分組及造模方法

20 只大鼠采用隨機數字表法分為對照組10 只、實驗組10 只。對照組每日予以普通飼料喂養，共10周。實驗組每日予自制高脂飼料喂養持續10 周。10 周后采集大鼠腹主動脈血檢驗HLP 造模是否成功。造模成功標準：與對照組比較，實驗組大鼠血漿中總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein，LDL-C）水平升高，高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein，HDL-C）水平降低，差異有統計學意義（P＜0.05），提示大鼠HLP 模型制備成功[9-10]。

1.4 檢測標本采集與處理

大鼠造模10 周結束后，進行標本采集，所有大鼠采集標本前禁食不禁水12 h，兩組大鼠腹腔麻醉，待麻醉成功后，取仰臥位，打開腹腔，充分暴露其腹主動脈，用一次性采血針在腹主動脈分叉處與血管平行插入，接入真空抗凝管采集血液標本，靜置15 min 后，4 ℃、3 000 r/min 離心10 min，離心半徑6.0 cm，取血清分裝，于-80 ℃冰箱保存。取大鼠前列腺，稱重，大鼠前列腺用預冷PBS 液在玻璃培養皿中清洗，然后放入4%PBS 中，用于做蘇木精-伊紅染色及病理檢測。

1.5 觀察指標

1.5.1 體重及前列腺濕重 實驗大鼠進行1 周適應性喂養后進行初次體重測量，根據初次體重結果采取隨機數字表法分組，分為實驗組10 只，對照組10只。之后每周測量大鼠體重1 次，為減少誤差，保證后續測體重時間與初次測體質量時間均為上午8∶00 至9∶00 大鼠未進食之前；取材前最后一次對大鼠重量進行測量。大鼠麻醉成功后，剖腹，充分游離前列腺，取出后以吸水紙吸干水分，立即稱重并記錄。

1.5.2 血脂四項指標測定 TG、TC 采用氧化酶偶聯比色終點法檢測，HDL-C、LDL-C 采用消除法檢測。

1.5.3 炎癥因子指標ELISA 檢測 大鼠腹主動脈采血后于-80 ℃冰箱保存。檢測時從4℃冰箱取出試劑盒，在室溫（18～25 ℃）平衡后使用。按照對應試劑盒說明書檢測血清中LEP、PSA、IL-6、IL-8 水平。

1.5.4 前列腺組織病理檢測 大鼠前列腺組織取出后，用預冷PBS 液在玻璃培養皿中清洗，然后放入4%PBS 中24 h，在梯度乙醇中進行脫水，石蠟包埋機包埋，用組織切片機切成4 μm 的薄片，進行蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察組織病理學變化。

1.6 統計學方法

采用SPSS 26.0 統計學軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，比較采用t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況、血脂四項及成模率情況

實驗組10 只大鼠造模過程中出現進食減少、活動量減少、活躍度較前降低、毛發光澤變淡等現象；對照組10 只大鼠造模全程進食、活動量、活躍度、毛發光澤程度正常。造模結束后檢測20 只大鼠血脂四項，結果顯示，實驗組TC、TG、LDL-C高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；實驗組HDL-C 低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。實驗組10 只大鼠高脂血癥模型造模成功，成模率為100%。見表1。

表1 兩組TC、TG、HDL-C、LDL-C 比較（U/L，）

表1 兩組TC、TG、HDL-C、LDL-C 比較（U/L，）

注TC：總膽固醇；TG：甘油三酯；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇。

2.2 兩組體重、前列腺濕重、前列腺指數比較

實驗組體重低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；實驗組前列腺濕重、前列腺指數高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組體重、前列腺濕重、前列腺指數比較（）

表2 兩組體重、前列腺濕重、前列腺指數比較（）

2.3 兩組LEP、IL-6、IL-8、PSA 比較

實驗組LEP、IL-6、IL-8、PSA 高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組LEP、IL-6、IL-8、PSA 比較（）

表3 兩組LEP、IL-6、IL-8、PSA 比較（）

注LEP：瘦素；IL：白細胞介素；PSA：前列腺特異性抗原。

2.4 前列腺病理

蘇木精-伊紅染色顯示：對照組前列腺組織腺泡形態規則，被覆單層上皮細胞，腔內有均勻的嗜酸分泌物，無空泡形成，少量腺上皮呈乳頭狀向腺腔內突出，間質緊密，血管擴張不明顯。見圖1。實驗組腺泡不規則，大部分腺泡上皮顯著增生，呈復層或假復層上皮細胞，腔內分泌物減少，大量腺上皮呈乳頭狀向腺腔內突出，部分腺泡可見大量脫離上皮，間質增多，血管擴張，間質局部大量炎癥細胞浸潤。見圖2。

圖1 大鼠前列腺組織圖片（100×）

圖2 大鼠前列腺組織蘇木精-伊紅染色結果（100×）

3 討論

到目前為止，BPH 的病因及發病機制包括多種學說，但包括炎癥信號傳導學說等，任意一種學說均不能獨立解釋BPH 的發病機制。BPH 與HLP 常伴隨出現，近年來研究發現HLP 可能是BPH 的病因學之一，且相互影響[11]。既往國內外研究者大多從臨床角度研究HLP 與前列腺增生之間關系，從血脂代謝與前列腺增生關系，或血脂指標與前列腺體積之間關系推測二者聯系，發現HLP 與BPH 關系密切[7-8，12]。也有資料顯示，動物蛋白、脂肪的攝入量增加和BPH 的發生有關，是BPH 發生危險因素[13-15]。大量調查資料顯示高脂肪、高熱量飲食與BPH 發病率之間呈正相關[16-18]。食物中的脂肪酸也在一定程度上影響著前列腺組織的生長[19]。本研究從實驗角度出發，應用高脂飼料構建HLP 大鼠前列腺增生模型，檢測大鼠血脂、LEP、IL-6、IL-8、前列腺病理，探討大鼠發生HLP 時前列腺增生病理狀態。

前列腺濕重、PSA、前列腺組織病理檢測為判斷前列腺是否增生常用重要指標。PSA 是一種分子量為33 kD 的雄性激素調節絲氨酸蛋白酶，由前列腺上皮及尿道旁腺生成，以酶原（proPSA）形式貯存在前列腺腺管中。Stamey 等[20]認為PSA 低于9 ng/ml 時，BPH 是導致PSA 升高的主要因素之一。本實驗結果顯示，兩組大鼠前列腺濕重、前列腺指數、PSA 比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。實驗組前列腺組織病理結果顯示，大部分腺泡上皮顯著增生，呈復層或假復層上皮細胞，大量腺上皮呈乳頭狀向腺腔內突出，以上結果綜合顯示HLP 大鼠前列腺增生模型構建成功。

本實驗造模時間及高脂飼料組成及干預方式參照既往實驗[21-23]。既往實驗用高脂飲食誘導前列腺增生造模時間多為8 周[24]；誘導方式亦多為喂養方式，亦有高脂肪乳灌胃方式。考慮到成模時間及成模率等問題，本實驗造模方式為高脂飼料喂養10 周。在造模過程中發現，實驗組高脂飼料喂養后出現進食減少，體重增長不明顯等現象，造模結果也顯示，實驗組體重低于對照組，還需關注高脂飼料喂養模式可能會導致大鼠前列腺濕重、前列腺指數出現較大差異。本實驗結果也顯示，高脂飼料誘導的大鼠TG 及LDL-C 升高不明顯。由此啟發，在進行高脂飼料誘導前列腺增生造模時可以采取多種方式進行改進，例如改進高脂飼料各成分比例，將飼養方式改為高脂肪乳灌胃，降低因進食量不同多帶來的個體差異、提高高脂血癥成模率、縮短造模時間、以更接近人類脂質代謝途徑[25]。值得注意的是，通過高脂肪乳灌胃誘導HLP 造模時間多為1～2 周，考慮到高脂飼料誘導前列腺增生成模時間及成模率等問題，可適當延長高脂肪乳劑灌胃時間[25]。

慢性炎癥在促進前列腺增生發生、發展中起著重要作用，HLP 其中重要病理狀態為LEP 水平升高，高LEP 可導致促進炎癥因子分泌產生致炎作用[26-27]。致炎作用導致機體處于全身性的慢性低度炎癥狀態，這種炎癥狀態誘導促炎因子分泌，包括IL-6、IL-8 等。IL-6 在感染和損傷時產生[28]；IL-8 參與炎癥反應諸多環節，其檢測水平升高是BPH 發生、發展的重要預測因子[29]。前列腺增生及HLP 二者共有的炎癥狀態提示HLP 誘導的前列腺增生可能機制之一為炎癥反應，因此將LEP、IL-6、IL-8 作為測試指標。本實驗結果也顯示，實驗組LEP、IL-6、IL-8 高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

此外實驗組腺泡形態不規則、大部分腺泡上皮顯著增生，腔內分泌物減少，大量腺上皮呈乳頭狀向腺腔內突出，間質增多，間質局部大量炎癥細胞浸潤，這也提示經高脂飼料誘導后前列腺組織局部發生炎癥反應。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。