標本溶血對陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥患者血生化項目檢測影響的實驗室處理路徑研究

艾麗皮熱·帕爾哈提 王 琳 蘇看看 張炳峰 穆 原 張世昌 張潔心

南京醫科大學第一附屬醫院檢驗學部，江蘇南京 210029

陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH）是一種克隆性造血干細胞疾病[1-4]。該病主要特征有溶血性貧血、骨髓衰竭，血栓形成和外周血細胞減少[5-8]。患者治療期間需監測肝腎功能、心功能和血糖等，以便準確評估臟器損傷，及時變更用藥方案[9-12]。但PNH 患者的血清標本常發生嚴重溶血。血生化項目易受溶血影響[13-15]。未經溶血校正的檢測報告很有可能誤導主診醫生判斷，造成嚴重后果。但是目前沒有可供實驗室參考使用的校正方案。日常工作中部分PNH 患者同時留取的血漿標本并無溶血現象。由此可知，離心操作時紅細胞受惰性分離膠擠壓而破碎引起不同程度溶血。本研究通過體外實驗首先明確受擠壓式溶血影響顯著的生化項目，再建立血清溶血校正方程和血漿參考區間，達到客觀解讀檢驗報告的最終目標。

1 資料與方法

1.1 一般資料

按美國臨床和實驗室標準協會文件C28-A3《臨床實驗室如何制定參考區間》[16]及我國衛生行業標準WS/T 402-2012《臨床實驗室檢驗項目參考區間制訂》[17]要求，對南京醫科大學第一附屬醫院體檢中心2022年11 月至2023 年4 月的體檢者進行篩選，包括年齡、生活習慣、工作條件等社會人口基本情況及手術史，用藥史，全身疾病史[9]。選取健康體檢者共275 名為研究對象。本研究經南京醫科大學第一附屬醫院倫理委員會審批（2022-SR-505）。

1.2 納入標準

①年齡18～79 歲；②既往身體健康；③近期未曾大量失血，手術或服用藥物；④檢驗科生化室開展的血生化28 項檢測結果均在正常參考范圍。

1.3 排除標準

①有陣發性睡眠性血紅蛋白尿，血栓形成，骨髓衰竭、泌尿生殖道感染；②有消化系統疾病、呼吸系統疾病、高血壓、冠心病、糖尿病、腫瘤等；③有腹痛、靜脈血栓、肺動脈高壓、吞咽困難、肝脾腫大等臨床癥狀；④貧血、全血細胞計數減少或紅系伴粒系或血小板計數減少、外周血出現幼紅細胞及嗜多染紅細胞、尿潛血實驗陽性；⑤酸化溶血試驗、蔗糖溶血試驗、蛇毒因子溶血試驗、補體溶血敏感試驗和尿含鐵血黃素試驗陽性；⑥血管內溶血，流式檢測提示血細胞表面糖基磷脂酰肌醇（glycosyl phosphatidyl inositol，GPI）錨連蛋白缺陷，鐵缺乏，含鐵血黃素尿；⑦有營養不良，有素食、酗酒、嗜煙等習慣；⑧處于妊娠期或哺乳期的婦女；⑨檢驗科生化室開展的血生化28 項中一項及以上檢測結果超過正常參考范圍。

1.4 血標本采集和檢測

①納入25 名健康體檢者。各收集1 份EDTA-K2抗凝管靜脈血，3 000 r/min，離心半徑22.8 cm，離心10 min 分離紅細胞；同時收集2 份黃色促凝管靜脈血，3 000 r/min，離心半徑22.8 cm，離心10 min 分離血清。PBS 清洗紅細胞2 次。各體檢者血清重懸自身紅細胞，使用頭皮針反復吹打致紅細胞破碎，得到梯度模擬溶血液。未溶血血清和模擬溶血液分別檢測溶血指數及生化28 項，記錄結果。②納入250 名健康體檢者。各收集1 份肝素鋰抗凝管靜脈血和1 份黃色促凝管靜脈血。3 000 r/min，離心半徑22.8 cm，離心10 min分離肝素鋰抗凝管血漿；3 000 r/min，離心半徑22.8 cm，離心10 min 分離黃色促凝管血清。分別檢測多個血生化項目，記錄結果。所有血標本均無溶血、黃疸和脂濁。

1.5 儀器與試劑

總膽紅素（total bilirubin，TBil）、直接膽紅素（direct bilirubin，DBil）和肌酐（creatinine，CREA）試劑購自上海科華生物工程股份有限公司，批號分別為TBil（20210722）、DBil（20210712）和CREA（20210812）。脂蛋白a 試劑購自日本株式會社島研究所，批號為UJ22。視黃醇結合蛋白試劑購自南京諾爾曼生物技術有限公司，批號為21112611。腺苷脫氨酶試劑購自浙江東甌診斷產品有限公司，批號為2021040027。其余試劑購自美國貝克曼庫爾特有限公司，批號分別為丙氨酸氨基轉移酶（8891）、天門冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST；0264）、堿性磷酸酶（9816）、谷氨酰轉肽酶（glutamyl transpeptidase，GGT；9725）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH；9735）、肌酸激酶（creatine kinase，CK；9861）、α-羥丁酸脫氫酶（α-hydroxybutyrate dehydrogenase，α-HBDH；9852）、總蛋白（total protein，TP；0008）、白蛋白（9771）、糖（8808）、尿素（urea，UR；0450）、尿酸（9708）、鈣（8516）、磷（phosphorus，Phos；9175）、鎂（9116）、鉀離子（potassium，K+；9043）、鈉（9043）、氯（9043）、總膽固醇（total cholesterol，TC；8562）、甘油三酯（0161）、高密度脂蛋白膽固醇（9751）和低密度脂蛋白膽固醇（0385）。使用美國貝克曼庫爾特實驗系統（蘇州）有限公司AU5800全自動生化分析儀檢測溶血指數及生化項目，反應參數參照儀器配套的操作說明書設置。

1.6 建立血清溶血校正方程

將每份模擬血溶液按溶血指數分組，即血紅蛋白濃度50～99 mg/dl時溶血指數為1+；血紅蛋白濃度100～199 mg/dl 時溶血指數為2+；血紅蛋白濃度200～299 mg/dl 時溶血指數為3+。分別計算28 項生化項目實測值與原始值間的偏倚，即溶血檢測偏倚（hemolysis bias，BH）=（實測值-原始值）/原始值。分別計算每個項目各組BH的均值和標準差。以溶血指數為橫坐標，BH均值為縱坐標作圖，得到每個項目的血清溶血校正方程。

1.7 建立血漿參考區間

分別計算每個體檢者各生化項目血漿檢測值與血清檢測值的偏倚，即血清檢測偏倚（serum bias，BS）=（血漿檢測值-血清檢測值）/血清檢測值。將各生化項目BS均值與2019 年WESTGARD QC（https：//www.westgard.com/biodatabase1.htm）中規定偏倚相比較，確定需建立血漿參考區間的項目。若數據呈高斯正態分布，用（x±1.96 s）表示95%數據分布范圍；若是數據不呈高斯正態分布，則單側采用P5 的下限或P95 的上限，以此確定檢驗項目的血漿參考區間。

參考區間的變異主要由個體內生物學變異（within-subject variation，CVI）和個體間生物學變異（between-subject variation，CVG）決定，兩者共同組成了人群生物學變異。而分析偏倚（analysis bias，BA）的存在會引起人群的錯誤劃分，適當BA應為，最低BA應為[18]。將250 例體檢者的血漿、血清標本分別檢測上述受擠壓式溶血影響較大的11 個生化項目，逐一比較血漿結果與血清結果間的差異，判斷是否需要建立血漿參考區間。

1.8 統計學方法

采用四分位間距法剔除均值±1.5 倍四分位間距之外的離群數值。采用假設檢驗方法分析數據分布情況。采用Microsoft Excel 軟件錄入數據和繪制趨勢線。

2 結果

2.1 成功建立8 個項目的血清溶血校正方程

按溶血指數將模擬溶血液分成三組，分別是溶血指數1+組含26 份模擬溶血液，溶血指數2+組含41份模擬溶血液和溶血指數3+組含30 份模擬溶血液。將上述各模擬溶血液進行28 個生化項目檢測，計算得到每個項目各組BH的均值和標準差。其中，AST、GGT、LDH、CK、α-HBDH、TC、TP、UR、CREA、Phos 和K+共11 個項目受溶血影響較大，見表1。其中8個項目可建立溶血校正方程，所得R2均＞0.90。見圖1。

圖1 8 個生化項目的血清溶血校正方程及特征參數

表1 11 個血生化項目的BH 均值和標準差（n=30）

2.2 成功建立5 個項目的血漿參考區間

經統計分析，剔除離群40例，納入210 例，其中男110 例，女100 例，男性年齡17～73 歲，女性年齡16～79 歲。AST 項目的BS超過規定適當BA，LDH、TP、Phos 和K+4 個項目的BS超過規定最低BA，因此需建立這5 個生化項目的血漿參考區間。5個項目的血漿檢測結果均符合正態分布，根據x±1.96 s 可得對應血漿參考區間。AST 血漿參考區間為（21.9±10.5）U/L，LDH為（166±58）U/L，TP 為（71.3±10.8）g/L，Phos 為（1.14±0.37）mmol/L，K+為（3.66±0.61）mmol/L。見表2。

表2 5 個血生化項目的規定BA 和BS 的比較（%）

3 討論

PNH 患者X 染色體上的磷脂酰肌醇聚糖-A 類基因發生突變，使其血細胞表面的兩種GPI 錨連蛋白CD55 和CD59 缺失，導致血細胞破壞溶解[19-25]。處于PNH 發病期患者的血生化項目如AST、LDH 和α-HBDH 的檢測結果常遠高于參考區間上限。更值得注意的是，患者血清K+多為危急值（＞6 mmol/L）。但部分患者表示僅有體力欠佳和運動后心慌表現。因此，發生溶血的血清生化檢測結果與患者實際情況不符，不具有臨床參考意義。對于受擠壓式溶血影響較大血生化項目的檢測，本研究通過建立血清溶血校正方程和血漿參考區間，向臨床提供兩種實驗室處理路徑：①優先使用肝素鋰抗凝管留取患者血標本進行血漿生化項目檢測；②對于已發生溶血的血清標本，使用血清溶血校正方程進行處理。本研究結果填補了PNH血生化項目檢測方面的空白，為PNH 檢驗流程進一步優化提供必要依據，服務臨床，造福患者。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。