女貞子中主要活性成分紅景天苷和特女貞苷的逆轉鐵過載促進骨形成相互作用研究

何丹丹 趙白秀 汪華君 蔣俊* 沈袁佳怡 何津津

1.南京中醫藥大學附屬中西醫結合醫院,江蘇 南京 210028

2.江蘇大學藥學院,江蘇 鎮江 212013

3.江蘇大學附屬醫院,江蘇 鎮江 212000

絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是最普遍的原發性骨質疏松癥之一[1],其特征在于雌激素水平和骨密度降低,骨骼微觀結構破壞,骨脆性和骨折易感性增加[2]。PMOP的常見和嚴重危害是多部位發生脆性骨折,尤其是髖部和椎骨骨折[3-4]。在世界范圍內,超過50%的絕經后婦女患有PMOP[5],PMOP已經成為危害中老年婦女健康的重大疾病之一[6-7]。除雌激素缺失外,鐵過載是PMOP所伴隨的不可忽視的危險因素。女性每年約有36 mg鐵通過月經排出[8],然而停經后5～10年內,鐵蓄積可導致血清鐵蛋白水平上升2～3倍[9]。研究表明,血液、組織中游離鐵蓄積過多則會誘發骨量降低、破壞骨微結構和骨的生物力學強度[10]。因此,篩選出能下調鐵過載、逆轉鐵代謝紊亂的有效中藥是防治PMOP的創新策略。女貞子是木犀科植物女貞LigustrumlucidumAit.的干燥成熟果實[11],在2020年版《絕經后骨質疏松中醫臨床指南》中被強推薦為抗PMOP有效藥物。女貞子中含有苯乙醇類、環烯醚萜類和三萜類等多種類型的活性化合物,且苯乙醇類和環烯醚萜類[12]的含量最高。紅景天苷、特女貞苷分別是苯乙醇類和環烯醚萜類的代表性成分,也是藥典中女貞子飲片的質控指標[13];特女貞苷、紅景天苷的抗PMOP的藥理作用已有報道[14-16],但兩者間的藥效學相互作用研究未見報道。

藥效學相互作用形式包括協同作用、相加作用和拮抗作用,主要表現為藥理效應改變引起的藥效和(或毒性)的改變,表現在同一受體部位或相同生理系統上作用的相加(1+1=2)、協同(1+1>2)或拮抗(1+1<1)[17-18]。為闡述特女貞苷和紅景天苷的抗PMOP效應以及兩者間的相互作用,本研究采用檸檬酸鐵銨建立鐵過載誘導的斑馬魚骨質疏松模型,茜素紅染色后以骨骼染色面積和累積光密度評價特女貞苷、紅景天苷對鐵過載誘導的骨形成抑制的逆轉作用,并進一步采用等效線法、等輻射分析法探討特女貞苷與紅景天苷間的相互作用,為揭示女貞子中主要活性成分紅景天苷和特女貞苷的抗PMOP的相互作用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

去鐵胺(DFO,諾華制藥有限公司);檸檬酸鐵銨(FAC,邁瑞爾生化公司);茜素紅(上海泰坦科技股份有限公司);紅景天苷標準品(純度≥98%,南京源植生物科技公司);特女貞苷標準品(純度≥98%,南京源植生物科技公司);95%甲醛(純度≥95%,上海泰坦科技股份有限公司);3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(MS222,純度≥98%,Adamas-reagent)。

1.2 實驗動物與試藥

野生型斑馬魚胚胎(AB系),由南京一樹梨花生物科技有限公司提供。E3培養液的配制按照之前的研究進行[19-20]。取適量紅景天苷與特女貞苷,精密稱定,用DMSO/E3溶液配制成濃度為100 μmol/L的儲備液,再用梯度稀釋法分別配制成不同濃度(1、5、25、50、100 μmol/L)的工作液。取適量FAC,將其溶解于E3溶液,配制成100 mg/L的溶液。

1.3 斑馬魚分組與處理

將受精后第2天(2 dpf)的斑馬魚幼魚分成14組,置裝有3 mL空白培養基的6孔板中(n=15)。具體分組如下:空白對照組(CON,E3培養液),二甲基亞砜組(DMSO),模型組(MX,100 μg/mL檸檬酸鐵銨),陽性對照去鐵胺組(DFO,100 μmol/L),紅景天苷組(1、5、25、50、100 μmol/L),特女貞苷組(1、5、25、50、100 μmol/L),紅景天苷與特女貞苷1∶1混合組(1、5、25、50、100 μmol/L)。斑馬魚具體的培養和給藥方法見本課題組之前發表的論文[21]。

1.4 茜素紅染色

連續給藥4 d后,收集所有斑馬魚,每孔用4 mL MS-222 (100 mg/L)溶液麻醉30 min處死。隨后用4 mL 10%甲醛PBS溶液固定斑馬魚的形態和組織,去除固定液后用50%乙醇溶液洗10 min,吸干后加入茜素紅溶液(0.5% KOH)染色放置過夜。除去并洗凈染色溶液,加入新鮮制備的漂白液(1% KOH和1.5% H2O2)漂白1 h,并放置于50%甘油/50% PBS溶液中保存。

1.5 骨礦化分析

按本課題組已成功構建的方法[22],在正置顯微鏡下(Olympus BX41,日本)觀察斑馬魚骨骼的染色情況,對斑馬魚的骨礦化面積(AMB)和累積光密度(COD)進行定量分析。使用Image J軟件計算AMB和COD,并用Graphpad Prism 9.0進行統計分析。

1.6 相互作用評價

按照Probit法[23]計算得紅景天苷、特女貞苷及兩者聯合用藥后的EC50及95%CI。采用等效線法、等輻射分析法[24]共同評價紅景天苷與特女貞苷的藥效學相互作用。①等效線法計算方法:等效線法是一種常用的藥物相互作用評價方法,它適用于藥物與效應呈劑量依賴關系的情況,其通過計算相互作用指數(interaction index,γ)來評價藥物協同作用的不同程度。等效線法的計算公式為γ=a/A+b/B,其中a和b代表聯合使用時兩藥的劑量,A和B代表單獨使用時達到與聯合使用時等效的兩藥的劑量。當γ=1時,兩藥呈相加作用;當γ<1時,兩藥呈協同作用;當γ>1時,兩藥呈拮抗作用。②等輻射分析法計算方法:橫、縱軸標記單獨用藥EC50值和95%CI,連接兩EC50值構成相加線,連接兩置信限構成相加線的95%CI。當聯合用藥EC50處于相加線上或置信限內,表示相加作用;處于置信限下方,表示協同作用;處于置信限上方,表示拮抗作用。

1.7 統計學分析

使用Graphpad Prism 9.0進行統計分析,采用Graphpad Prism 9.0中Tukey檢驗確定各組之間的差異,實驗數據用均數±標準差表示,P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 紅景天苷和特女貞苷對骨礦化的影響

茜素紅染色結合圖像量化結果表明,與空白組和二甲基亞砜組相比,模型組AMB和COD顯著減少(P<0.05)(圖1、2),表明檸檬酸鐵銨成功地抑制了斑馬魚的骨骼生長與骨礦化進程。與模型組相比,在不同濃度的紅景天苷、特女貞苷及其混合溶液的干預下,斑馬魚AMB和COD顯著增加(P<0.05),見圖1、2。結果表明,紅景天苷、特女貞苷及其混合溶液均有較好的逆轉鐵過載導致的骨形成抑制,且具有濃度依賴性。

圖1 茜素紅染色斑馬魚頭骨腹側視圖(×150)

圖2 紅景天苷、特女貞苷對斑馬魚骨礦化的影響 (n=15)

2.2 相互作用評價

2.2.1等效線法。紅景天苷、特女貞苷及其混合溶液對斑馬魚的骨礦化具有改善作用,紅景天苷與特女貞苷混合使用時,呈現出骨骼染色面積的顯著提高,且其混合之后的活性優于同濃度的紅景天苷和特女貞苷,見表1。

表1 不同濃度紅景天苷與特女貞苷及其混合溶液對骨骼染色面積的影響(n=15)

通過Probit法計算可得紅景天苷、特女貞苷及聯合用藥的EC50分別為0.85、0.92、1.02 μmol/L。紅景天苷、特女貞苷及其混合溶液的效應變化和量效關系見圖3。用等效線法計算公式γ=a/A+b/B,計算得相互作用系數γ=1.16。γ>1,表明紅景天苷與特女貞苷1∶1聯合用藥時,未見明顯的協同作用。

圖3 紅景天苷、特女貞苷及其混合溶液的效應變化與量效關系圖

2.2.2等輻射分析法。運用等輻射分析法對紅景天苷與特女貞苷的相互作用進行評價,等輻射圖相加線的兩端分別為紅景天苷與特女貞苷有效增加AMB的EC50,紅景天苷和特女貞苷合用后的強度所在的點與相加線的兩個端點連接形成等輻射線,見圖4。混合組中相應成分的EC50比值分數總和為1.16,且其復合點落在95%可信限內(P>0.05)(表2)。等輻射分析法結果表明,紅景天苷和特女貞苷聯合用藥呈現相加作用。

表2 紅景天苷與特女貞苷單用及聯合使用后對骨骼染色面積增加的EC50及95%CI

圖4 紅景天苷與特女貞苷組合使用的等輻射圖

3 討論

鐵過載與骨代謝之間的關系是近年來的研究熱點,鐵過載產生大量活性氧會刺激破骨細胞分化,增加骨吸收,導致骨量流失;鐵過載誘導的氧化應激可導致骨形成和礦化受損[25-26]。斑馬魚模型在高鐵環境下骨礦化不全,早期表達的成骨基因下降,進而影響骨形成。鐵過載斑馬魚硬骨發育障礙,骨量減少,下調成骨相關基因的表達,從而造成骨發育遲緩[27]。通過逆轉鐵過載促進骨形成可以成為治療PMOP的一個新方案。中藥女貞子的藥理活性研究主要集中在抗OP、PMOP的作用[28-30],女貞子所含的化學成分也顯示出良好的抗骨質疏松活性[29],特女貞苷對破骨細胞的形成具有抑制作用,特女貞苷效應的分子機制包括抑制NF-κB活化和下游因子c-Fos和NFATc1的水平,以及抑制JNK和p38磷酸化。因此,特女貞苷可能有助于治療破骨細胞相關的骨病[14]。紅景天苷可激活PI3K/Akt信號,減輕PMOP大鼠骨組織病理損傷,提高骨礦鹽含量,改善骨生物力學[31],抑制氧化應激反應發揮骨細胞保護作用[16]。

本研究闡明女貞子中主要活性成分特女貞苷和紅景天苷的藥效學相互作用。目前,研究藥物間的相互作用方法較多,如等效線法、等輻射分析法和周-特氏聯合指數法等[32]。其中,等效線法和等輻射分析法是判斷藥物間相互作用的常用方法。本研究表明,紅景天苷、特女貞苷及其混合溶液對骨礦化呈濃度依賴的改善作用。藥效學相互作用評價結果顯示紅景天苷和特女貞苷呈相加作用關系。本研究為深入評價女貞子中多種活性成分之間相互作用機制奠定了基礎,為臨床上藥物聯合治療PMOP提供廣闊的發展空間。