miR-20a-5p調控NFKBIB對人腎母細胞瘤細胞WiT49裸鼠移植瘤增殖的影響

王雅琦 李萬富 阿依古再麗·麥麥江 艾尼娃·克然木 樊珈榕 梁鵬 娜菲沙·沙木西丁

新疆醫科大學第一附屬醫院小兒普外科 （烏魯木齊 830000）

腎母細胞瘤（Wilms tumor，WT）是兒童最常見的惡性腎腫瘤［1-2］。經過大型多中心研究，WT患兒的總生存率已達到90%［3］，但仍存在預后不佳的亞組［4］。因此目前關于WT的研究目標已轉變為優化風險分類，制定個體化治療策略［3，5］。miRNAs是一類具有調控功能的非編碼RNA，已被證明可以調節腎臟形態的發生［6］。如部分WT患兒表現出miRNA有害突變［7-8］。免疫反應調節因子NF-κB與癌癥密切相關［9］。目前已經發現一些miRNA可以調節NF-κB的激活［10-11］。NF-κB轉錄因子抑制蛋白NFKBIB（IκBβ）可以阻礙NF-κB的激活［12］。但miRNA通過調控NFKBIB影響NF-κB通路激活方面還少見報道，為此，我們前期通過體外實驗得到miR-20a-5p在人腎母細胞瘤細胞系WiT49中高表達，且miR-20a-5p可能是通過調控NFKBIB激活NF-κB通路促進WiT49細胞功能。本研究經新疆醫科大學第一附屬醫院醫學倫理委員會審批（倫理審批號：K202309-32），擬通過生物信息學分析驗證miR-20a-5p在人腎母細胞瘤中高表達，并通過動物實驗進一步驗證在裸鼠體內miR-20a-5p表達水平對WiT49移植瘤的生長影響以及作用機制，為腎母細胞瘤的診療及預后預測尋找新的生物標志物，指導臨床個體化治療。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞系及實驗動物人胚腎細胞293T及人腎母細胞瘤細胞系WiT49購自武漢普諾賽生命科技有限公司；BALB/c Nude小鼠購自斯貝福（北京）生物技術有限公司。

1.1.2 主要試劑與耗材胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司，miR-20a-5p過表達及干擾慢病毒載體購自上海吉凱基因科技有限公司（上海，中國），雙熒光素酶報告系統試劑盒購自上海普洛麥格生物產品有限公司，鹽酸塞拉嗪注射液購自吉林省華牧動物保健品有限公司，細胞RNA提取試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司，逆轉錄和實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司，miR-20a-5p、NFKBIB及NF-κB引物購自上海生工生物工程有限公司（上海，中國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 差異基因及共表達分析從GEO公共數據庫下載基因表達芯片，獲取正常腎組織樣本及腎母細胞瘤組織樣本的miRNA測序數據，使用GEO2R在線分析工具進行差異分析，取adj.P＜0.05且|logFC| ≥ 1為差異miRNA；通過cBioPortal數據庫獲得共表達基因，Spearman相關性分析R值為0～0.3代表弱或者不相關；0.3～0.5代表弱相關；0.5～0.8代表中等程度相關；0.8～1代表強相關。

1.2.2 雙熒光素酶酶實驗通過targetscan數據庫預測差異miRNA靶基因；通過雙熒光素酶實驗驗證，將用于轉染的人胚腎細胞293T細胞放入96孔板中，待細胞密度達到50%～70%，將培養基與目的質粒以及目標基因充分混勻后室溫放置（溶液A），之后將培養基與轉染試劑充分混勻放置（溶液B），將溶液A與溶液B充分混勻，室溫放置20 min，將轉染混合物加入96孔板混勻，37 ℃、5% CO2條件下的培養箱中進行培養48 h后收集細胞，按照雙熒光素酶報告系統試劑盒試劑盒進行檢測。

1.2.3 細胞培養人腎母細胞瘤細胞系WiT49用含10%胎牛血清的DMEM培養液培養，并在培養液中加入1%的青霉素和鏈霉素。在37 ℃、5% CO2條件下的培養箱中進行培養，待細胞密度達80%～90%時，按比例用胰蛋白酶消化液（0.25% EDTA）消化后傳代。

1.2.4 慢病毒轉染將細胞以2 × 105/孔鋪到6孔板中，待細胞密度達80%～90%，按照慢病毒產品手冊，在6孔板中按照miR-20a-5p過表達組滴度：3E+8，miR-20a-5p低表達組滴度：5E+8加入病毒懸液，在37 ℃、5% CO2條件下的培養箱中進行培養，顯微鏡觀察熒光蛋白，轉染效率達80%時使用6 μg/mL嘌呤霉素篩選穩度表達細胞系。

1.2.5 裸鼠成瘤實驗

1.2.5.1 實驗分組選取4～6周齡，體質量（20±2）g的SPF級雌性裸小鼠12 只，飼養于新疆醫科大學動物實驗中心。飼養溫度（23±3）℃，相對濕度40%～70%。經適應性飼養后均分為3組：WiT49模型組（4只）、WiT49-miR-20a-5p過表達組（4只）、WiT49-miR-20a-5p敲低組（4只）。

1.2.5.2 實驗步驟

1.2.5.2.1麻醉劑配制按舒泰65 mg/kg+鹽酸賽拉嗪10 mg/kg溶于滅菌注射用水中，濃度及劑量按照動物實際體質量計算。

1.2.5.2.2 模型建立取各組穩定表達的WiT49細胞，制成5 × 106·mL-1的細胞懸液，再與基質膠1∶1混合均勻，分別向各組裸鼠右側腋窩皮下注射200 mL的細胞混合液。

1.2.5.2.3 造模后觀察指標見瘤后，每4天測量各組裸鼠體質量，用游標卡尺測量裸鼠的皮下瘤塊直徑并拍照留圖。待瘤塊平均直徑超過20 mm取血、處死，取其完整瘤塊組織，游標卡尺測量瘤塊體積及重量。

1.2.5.2.4 樣本收集血清樣本：各組裸鼠麻醉，摘眼球取血1 mL左右，在4 ℃，3 000 r/min離心10 min，取上清液單獨分裝，保存于-80 ℃。瘤塊組織：各組裸鼠處死，取完整瘤塊組織，先對瘤塊拍照，測量體積并稱重后直接液氮速凍，保存于-80 ℃。

1.2.6 總RNA提取和qRT?PCR檢測按RNA試劑盒說明書提取瘤塊組織總RNA，檢測其濃度，按照逆轉錄試劑盒說明書操作得到cDNA。分別配置miRNA及mRNA熒光定量PCR反應體系，對miR-20a-5p、NFKBIB及NF-κB進行qRT-PCR擴增檢測，內參為mouse-actin。按照qRT-PCR試劑盒說明書操作。用2-ΔΔCt法計算各組細胞中基因的相對表達量。

1.2.7 CCK?8細胞增殖實驗制備各組細胞懸液并計數后接種在96孔細胞培養板中（1 × 104個細胞/μL/100孔），37 ℃，5% CO2恒溫恒濕培養箱分別培養0、24、48、72 h。每孔加10 μL CCK-8試劑，過程注意避光操作，繼續培養2 h后用酶標儀測定在450 nm的吸光度，反應細胞增殖能力。

1.3 統計學方法采用SPSS 26.0統計軟件進行分析，并使用GraphPad Prism 8軟件繪制圖片。符合正態分布的數據用（）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較進行單因素方差分析，相關性分析采用Spearman相關分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR?20a?5p在腎母細胞瘤中高表達，且與NF?κB表達呈正相關對比正常腎組織樣本及腎母細胞瘤組織樣本的miRNA測序數據，經過篩選得到21個上調基因和22個下調基因，使用omicshare繪制熱圖（圖 1），通過cBioPortal數據庫獲得與上調基因miR-20a-5p表達相關的NF-κB（r= 0.745，P＜0.001）。

2.2 雙熒光素酶實驗結果顯示miR?20a?5p與NFKBIB存在結合作用通過targetscan數據庫預測NFKBIB與miR-20a-5p具有相互結合位點；熒光素酶報告實驗結果表明，miR-20a-5p過表達對照組、miR-20a-5p過表達組的突變型3'-UTR熒光素酶活性為0.99±0.08、1.01±0.06，miR-20a-5p過表達對照組、miR-20a-5p過表達組的野生型3'-UTR熒光素酶活性為1.00±0.06、0.44±0.39，miR-20a-5p過表達組與過表達對照組的野生型熒光素酶活性比較，差異有統計學意義（P＜0.000 1）；miR-20a-5p過表達組與過表達對照組的突變型熒光素酶活性比較，差異無統計學意義（P= 0.539 9）。

2.3 裸鼠成瘤實驗顯示miR?20a?5p過表達促進人腎母細胞瘤細胞WiT49裸鼠移植瘤生長裸鼠成瘤實驗，造模第7天見瘤，造模第11天瘤塊平均直徑超過20 mm（圖2）。造模第11天（處死前）WiT49-miR-20a-5p過表達組裸鼠體質量高于WiT49模型組，差異有統計學意義（P= 0.011）；WiT49-miR-20a-5p敲低組裸鼠體質量與WiT49模型組差異無統計學意義（P= 0.863）。裸鼠處死后，WiT49-miR-20a-5p過表達組瘤塊體積及重量高于WiT49模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），WiT49-miR-20a-5p敲低組瘤塊體積及重量與WiT49模型組差異無統計學意義（P＞0.05）（表 1）。

圖1 正常腎組織和腎母細胞瘤組織之間差異miRNA熱圖Fig.1 Differentially expressed miRNAs heat maps between normal and Wilms' tumor tissues

圖2 各組裸鼠造模第11天瘤塊直徑Fig.2 The diameter of the tumor was 11 days in each group

2.4 qRT?PCR檢測各組裸鼠瘤塊結果顯示miR?20a?5p與NF?κB表達呈正相關，與NFKBIB表達呈負相關WiT49-miR-20a-5p過表達組瘤塊中miR-20a-5p及NF-κB表達高于WiT49模型組，NFKBIB表達低于WiT49模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），WiT49-miR-20a-5p敲低組瘤塊中miR-20a-5p及NF-κB表達低于WiT49模型組，NFKBIB表達高于WiT49模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）（表2），各組瘤塊中miR-20a-5p與NF-κB表達呈正相關（r= 0.933，P＜0.001），與NFKBIB表達呈負相關（r= -0.883，P= 0.003）。

2.5 CCK-8細胞增殖實驗提示miR-20a-5p過表達促進人腎母細胞瘤細胞WiT49裸鼠移植瘤細胞增殖0 h轉染各組WIT49細胞吸光度值差異無統計學意義（P＞0.05），24、48 h WiT49-miR-20a-5p過表達組細胞吸光度值高于WiT49模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），72 h細胞吸光度值差異無統計學意義（P＞0.05）；24、48、72 h WiT49-miR-20a-5p敲低組細胞吸光度值均低于WiT49模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）（表 3）。

表1 裸鼠處死前體質量、處死后瘤塊體積及重量Tab.1 Nude mice to death before the body weight，tumor volume and weight after death ±s

表1 裸鼠處死前體質量、處死后瘤塊體積及重量Tab.1 Nude mice to death before the body weight，tumor volume and weight after death ±s

注：與WiT49模型組比較，*P＜0.05

項目裸鼠體質量（g）瘤塊體積（mm3）瘤塊重量（g）WiT49-miR-20a-5p敲低組20.40±1.64 1 444.05±1 207.95 1.16±0.80 WiT49模型組20.28±1.48 2 042.00±391.00 1.52±0.32 WiT49-miR-20a-5p過表達組22.65±1.46*3 375.50±838.50*2.80±0.57*

表2 qRT-PCR檢測各組瘤塊中miR-20a-5p、NFKBIB及NF-κB表達水平Tab.2 The expression levels of miR-20a-5p，NFKBIB and NF-κB in tumor masses were detected by qRT-PCR ±s

表2 qRT-PCR檢測各組瘤塊中miR-20a-5p、NFKBIB及NF-κB表達水平Tab.2 The expression levels of miR-20a-5p，NFKBIB and NF-κB in tumor masses were detected by qRT-PCR ±s

注：與WiT49模型組比較，*P＜0.05

項目miR-20a-5p NFKBIB NF-κB WiT49-miR-20a-5p敲低組0.50±0.44*1.90±0.87*0.71±0.29*WiT49模型組1.01±0.47 1.01±0.48 1.02±0.15 WiT49-miR-20a-5p過表達組2.00±0.51*0.49±0.19*1.35±0.23*

表3 CCK-8細胞增殖實驗檢測各組WiT49細胞不同時間點細胞增殖情況Tab.3 CCK-8 cell proliferation assay was used to detect the proliferation of WiT49 cells in each group at different time points ±s

表3 CCK-8細胞增殖實驗檢測各組WiT49細胞不同時間點細胞增殖情況Tab.3 CCK-8 cell proliferation assay was used to detect the proliferation of WiT49 cells in each group at different time points ±s

注：與WiT49模型組比較，*P＜0.05

時間0 h 24 h 48 h 72 h WiT49-miR-20a-5p敲低組0.01±0.00 0.04±0.01*0.62±0.03*1.76±0.15*WiT49模型組0.01±0.00 0.28±0.01 0.89±0.21 2.83±0.01 WiT49-miR-20a-5p過表達組0.01±0.00 0.96±0.35*1.69±0.33*2.83±0.19

3 討論

WT是一種兒童胚胎性腫瘤［13］，起源于異常的腎形成，由于多學科協作的進展，WT患者的總體預后良好，但仍存在預后較差、復發率較高的亞組［14］。既往，兒童腫瘤協作組（COG）提出根據1p和16q位點的雜合性缺失對腫瘤進行分層，1p和16q染色體上的等位基因缺失或1q的增加等特征代表著臨床的高侵襲性，但這很難為WT靶向治療提供幫助［15］。有研究［16］利用WT的全基因組和全外顯子組測序發現了miRNA上的新突變。如miR-483-3p可通過失活PTEN、激活AKT信號通路對WT細胞起促進作用，下調miR-483-3p可提高WT對阿霉素治療的敏感性，抑制WT細胞［17］；miR-200b/c/429可通過調控NF-κB通路相關基因IKK-β抑制NF-κB通路，LINC00667可競爭性結合miR-200b/c/429調控IKK-β表達，進而激活NF-κB通路促進腎母細胞瘤的進展［18］。目前，一些基于miRNA的藥物已處于臨床試驗中［19］。NF-κB是參與炎癥和癌變的重要轉錄因子［20］。正常情況下，NF-κB轉錄因子抑制蛋白IκB在細胞質中抑制NF-κB，機體受到刺激后，活化的IκB激酶使IκB磷酸化，進而誘導IκB泛素化和降解，解除抑制的NF-κB被釋放并轉運到細胞核中［21］，NF-κB的持續激活有助于包括WT在內的多種腫瘤細胞的增殖、侵襲及遷移［22］。

本研究通過GEO數據庫對比腎母細胞瘤及正常腎組織基因序列得到miR-20a-5p在腎母細胞瘤中高表達，通過Spearman相關性分析得到miR-20a-5p與NF-κB表達呈正相關，通過targetscan數據庫及雙熒光素酶實驗得到miR-20a-5p與NFKBIB存在結合作用，裸鼠成瘤實驗結果顯示miR-20a-5p過表達促進人腎母細胞瘤細胞WiT49裸鼠移植瘤的生長，敲低組與模型組的裸鼠體質量、瘤塊體積及重量差異無統計學意義，可能是因為WiT49惡性程度高，造模第11天瘤塊平均直徑就已達20 mm，為減少裸鼠痛苦，遂立刻將裸鼠處死，敲低組與模型組生長差異未完全體現。qRT-PCR檢測各組裸鼠瘤塊中的miR-20a-5p表達與NF-κB成正比，與NFKBIB成反比。CCK-8細胞增殖實驗顯示miR-20a-5p過表達促進人腎母細胞瘤細胞WiT49裸鼠移植瘤細胞增殖，72 h過表達組細胞和模型組差異無統計學意義，考慮是因為細胞增殖達96孔板生長上限。因此，結合本課題組前期體外實驗研究，我們進一步驗證了miR-20a-5p可能是通過調控NFKBIB激活NF-κB通路促進腎母細胞瘤細胞增殖、遷移、侵襲，抑制其凋亡。

此外，本課題組已有研究發現miR-20a-5p可通過NF-κB對神經母細胞瘤產生影響，這種共同信號通路背景下的討論可能有助于增進對兒童顱外實體瘤發生、發展相關機制的理解［23］。但本研究仍缺乏臨床資料驗證，因此本課題組今后將收集臨床樣本，完善蛋白質印跡及免疫組化等實驗，最終實現指導臨床靶向治療的目標。