存活素和細胞周期素依賴性蛋白激酶抑制因子2B在骨髓增生異常綜合征診斷及患者預后評估中的臨床價值研究

馬麗麗,付長江

(1.赤峰市醫院血液科,內蒙古 赤峰 024000;2.赤峰學院附屬醫院介入科,內蒙古 赤峰 024000)

骨髓增生異常綜合征(Myelodysplastic syndrome,MDS)是以血細胞性質、數量異常為主要特征惡性克隆性造血干細胞疾病,患者骨髓增生較活躍,外周血細胞減少,極易引發白血病,嚴重威脅患者生命健康[1-2]。該疾病高發于老年群體,發病隱匿,臨床常出現漏診和誤診現象,目前國內外研究重點一直放在診斷和治療方面[3-4]?，F階段外周血及骨髓形態學檢查、細胞遺傳分析、流式細胞免疫表型分析等是臨床常用的MDS診斷方式,具有一定應用價值,但仍缺乏識別惡性克隆的敏感度和特異性[5-6]。有研究[7-8]表明,MDS患者髓內無效造血主要原因可能是細胞過度凋亡,而造血細胞大量增殖會導致基因組不穩定,因此基因突變分析可能是MDS臨床診斷的新方式。存活素(Survivin)可以調控細胞增殖與凋亡,而細胞周期素依賴性蛋白激酶抑制因子2B(Cyclin dependent kinase inhibitor 2B,P15INK4B)有抑制分裂細胞的作用,可以控制細胞增殖[9]。但Survivin、P15INK4B在MDS中的研究較少,故本研究對MDS患者Survivin和 P15INK4B表達展開分析,探討其在MDS診斷及患者預后評估中的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年5月至2022年5月本院收治的MDS患者150例,設為觀察組,其中男性96例,女性54例;年齡49～68歲,平均(59.42±4.33)歲;體重指數(BMI)20～26 kg/m2,平均(23.01±1.08)kg/m2;高中及以下96例,大專及以上54例;低危45例,中危79例,高危26例;糖尿病32例,肺部疾病21例。病例納入標準:符合MDS診斷標準[10],臨床確診為MDS;心、肺、肝、腎等重要器官功能正常;精神和認知功能正常,可以進行有效溝通;各項數據資料完整,不會對研究結果產生影響;簽署知情同意書。排除標準:伴有先天性血液系統疾病;伴有惡性腫瘤、再生障礙性貧血及感染性疾病;免疫系統異常,可能影響研究結果;中途退出。另選取同期于本院進行體檢的健康者150例為對照組,其中男性94例,女性56例;年齡48～70歲,平均(59.88±4.25)歲;BMI 20～26 kg/m2,平均(23.14±1.21)kg/m2;高中及以下93例,大專及以上57例;低危47例,中危80例,高危23例;糖尿病30例,肺部疾病20例。兩組一般資料比較差異無統計學意義(均P>0.05)。本研究經本院醫學倫理委員會審核通過(倫理批號:20190425)。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞表面標記檢測:抽取所有研究對象1～2 ml骨髓,EDTA抗凝,幼稚細胞群、成熟粒細胞群和成熟單核細胞群采用CD45/SSC雙參數散點圖識別,流式細胞儀檢測不同細胞群的分化抗原表達。磷酸鹽緩沖液對細胞濃度進行稀釋,隨后室溫下進行單克隆抗體標記,將調整濃度后的100 μl單細胞懸液加入充分混合,再加入紅細胞裂解液2 ml,1500 r/min離心5 min,去除上層血清,磷酸鹽緩沖液洗滌1次,磷酸鹽緩沖液固定后上機檢測,統計陽性率(實際檢測到的基因例數占總例數的百分比)。

1.2.2 Survivin和P15INK4B mRNA表達檢測:細胞中總RNA采用TRIzol法提取,測定光密度值,隨后以β-actin為內參(正向引物序列為5’-CGCTGCCACCGTAATCCGGACA-3’,反向引物序列為5’-GTCACGCAATTTCGACCCCGCT-3’),采用反轉錄PCR(RT-PCR)檢測Survivin、P15INK4B mRNA表達。Survivin mRNA正向引物序列為5’-CTAUCTCAAGGTGCACCGCAGC-3’, 反向引物序列為5’-GAGGCCATGGCAGCCAGCTAC-3’,擴增條件:94 ℃預變性2 min,94 ℃變性45 s,72 ℃退火1 min,循環40次。P15INK4B mRNA正向引物序列為5’-ACGTCGCGGCAGCGATGCT-3’, 反向引物序列為5’-CUGTGGGTGCAUGTGGGAACA-3’,擴增條件:94 ℃預變性5 min,94 ℃變性30 s,56 ℃ 退火30 s,72 ℃延伸40 s,循環30次。

1.2.3 預后隨訪 對觀察組患者進行為期1年的隨訪。隨訪結束后,將病死者歸入病死組,將其余患者歸入存活組。

2 結 果

2.1 兩組Survivin、P15INK4B陽性表達率及mRNA表達水平比較 見表1(圖1、2)。觀察組Survivin陽性表達率及mRNA表達水平高于對照組,P15INK4B陽性表達率及mRNA表達水平低于對照組(均P<0.05)。

表1 兩組Survivin、P15INK4B陽性表達情況及mRNA表達水平比較

圖1 兩組Survivin陽性表達情況(×400)

圖2 兩組P15INK4B陽性表達情況(×400)

2.2 不同預后患者Survivin、P15INK4B mRNA表達水平比較 見表2。150例MDS患者中50例病死,1年生存率為66.67%(100/150)。病死組Survivin mRNA表達水平高于存活組,P15INK4B mRNA表達水平低于存活組(均P<0.05)。

表2 不同預后患者Survivin、P15INK4B mRNA表達水平比較

2.3 Survivin、P15INK4B對MDS的診斷價值 見表3。Survivin、P15INK4B對MDS均有較高診斷價值,兩者聯合檢測的診斷價值更高(Z=3.328、4.072,均P<0.05)。

表3 Survivin、P15INK4B對MDS的診斷價值

2.4 Survivin、P15INK4B對MDS患者不良預后的評估價值 見表4。Survivin、P15INK4B對MDS患者不良預后均有較高診斷價值,兩者聯合檢測的評估價值更高(Z=4.477、2.520,均P<0.05)。

表4 Survivin、P15INK4B對MDS患者不良預后的評估價值

3 討 論

MDS是以骨髓細胞異常分化、成熟和骨髓衰竭為特征的異質性骨髓腫瘤,部分患者病情數十年也無明顯變化,但部分患者從低危進展為高危后極易發展為白血病,更有部分患者因骨髓功能衰竭而病死[11-12]。有研究[13-14]表明,細胞凋亡屬于一種細胞死亡程序,具有保守性、遺傳性和漸進性等特點,該程序異常與MDS發病機制有關,具有獨特的生化和形態學特性。細胞凋亡異常往往與癌癥的發生具有緊密聯系,影響血液惡性腫瘤的發生和發展,進一步增加該疾病診斷難度[15-16]。因此,為尋找MDS更具特異性的診斷方式,為該疾病治療提供新靶點,本研究對 MDS患者凋亡抑制因子Survivin、P15INK4B陽性表達情況及mRNA表達水平進行分析,觀察其應用價值。

Survivin是具有抗細胞凋亡功能的凋亡抑制基因,且與一些腫瘤預后具有相關性[17-18]。P15INK4B屬于細胞周期負調控基因,有抑制細胞周期蛋白依賴激酶4、6的作用,進一步對細胞G1期至S期起到調控作用,故P15INK4B基因還屬于候補的腫瘤抑制基因[19-20]。本研究結果顯示,觀察組Survivin mRNA表達水平較對照組更高,P15INK4B mRNA表達水平較對照組更低,與MINAIYAN等[21]及LOUNTOS等[22]研究結果一致,提示MDS患者Survivin高表達,P15INK4B低表達。其原因可能是:外周分化成熟的細胞較少,但骨髓增生活躍,使骨髓中粒系、紅系和巨核系細胞凋亡增加,導致患者無效造血;Survivin只在轉化細胞和增殖細胞中被檢出,可以加速細胞有絲分裂,促使細胞快速分裂為相同的子細胞,其過度表達會導致癌細胞分裂旺盛,快速增殖,從而加速MDS發展[23-24]。同時,MDS發病機制之一為基因的高度甲基化,而基因高度甲基化會發生基因沉默,導致腫瘤細胞過度增殖,加速疾病發展[25]。P15INK4B作為候補腫瘤抑制基因,在多種惡性血液疾病中常表現為基因純合子缺失,甲基化異常,而P15INK4B基因甲基化與血液特征和細胞遺傳學具有相關性,超甲基化則會加快疾病進程[26]。本研究結果顯示,病死組Survivin mRNA表達水平較存活組更高,P15INK4B mRNA表達水平較存活組更低。

此外,本研究通過繪制ROC曲線發現,Survivin、P15INK4B表達水平對MDS具有一定診斷價值,對MDS患者不良預后同樣具有較高評估價值,兩者聯合檢測不但對MDS有更高的診斷價值,而且對MDS患者不良預后也有更高的評估價值,提示Survivin、P15INK4B檢測在MDS患者中具有較高的應用價值。

綜上所述,MDS患者Survivin高表達,且與患者預后呈正相關;P15INK4B低表達,且與患者預后呈負相關;兩者均可用于MDS的診斷及不良預后的評估,聯合檢測有更高的價值。但上述檢測對實驗操作的要求較高,可能不適用于所有醫院,后續還需進行更加深入的研究,為MDS的臨床診斷提供更加簡便、準確、科學的方法。