酶解血粉制備氨基酸水溶肥工藝條件優化

張洪志，沈 濤，杜新園，楊育乾

（寧夏夏盛實業集團有限公司，寧夏 銀川 750000）

我國是畜禽養殖大國，2019 年我國豬、牛、羊肉產量為8 363 萬t，屠宰加工過程中產生近50%的廢棄物，其中血液占30%左右。除作為工業原料及蛋白飼料外，大部分血液作為廢棄物被排放，導致環境污染和資源浪費［1］。利用動物血液生產氨基酸水溶肥是變廢為寶的途徑之一。氨基酸是目前農資市場中使用量較大的一種生物刺激素，可以作為一種有機氮源為植物代謝過程提供氮素，作為結構性分子用于合成蛋白質大分子，另外可以作為功能性分子參與植物各種生理活動［2］。丁恒毅［3］發現氨基酸肥料可以提升茶葉品質，增加茶葉中茶多酚、氨基酸、咖啡因等的含量，同時增強茶葉的口感；周輝軒等［4］研究發現，在桃樹幼苗期噴施氨基酸水溶肥能夠顯著促進幼苗的生長發育。蛋白多肽是一種新型的植物激素，其分子量比蛋白質更小，可以直接被植物吸收利用，葉面噴施蛋白多肽能促進植物干物質的積累，增強植物光合作用［5］，促進土壤微生物種群增加，有利于植物對鉀、鈣、鎂、鐵、鈉等元素的吸收［6］。

目前，國內對利用商業化蛋白酶酶解動物血液制備氨基酸水溶肥的研究較少，且主要集中在動物血液廢棄物分解菌的篩選和鑒定等方面的基礎研究。周毅等［7］對生豬屠宰場下水道土壤中的微生物進行分離，獲得一株產酶能力較高的菌株B12，所產蛋白酶活力最高可達185.58 U/mL；周雪雁等［8］以屠宰場廢棄血液堆積處土壤樣品為材料，獲得了能夠有效降解廢棄血液的功能菌株，其蛋白酶活力為188.63 U/mL；蔡藝菲等［9］以豬血為原料，利用風味蛋白酶水解豬血中的蛋白質，在液料體積質量比10.5 mL/g、pH 6、水解溫度50 ℃、每克蛋白酶活力為12 000 U、水解時間7 h的條件下，蛋白水解度為40.42%。

利用商業化蛋白酶水解血液制備氨基酸水溶肥的研究雖有報道，但是蛋白水解度不高，氨基酸產率低。本實驗利用組合蛋白酶探究酶解參數對酶解效果的影響，提高血粉蛋白的水解度，增加酶解液中氨基酸含量，為蛋白酶酶解血液制備氨基酸水溶肥的過程控制及規模化應用提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料

干燥血粉（血液噴霧干燥制成），由青島中科興海生物科技有限公司提供，w（蛋白質）87.5%。

蛋白酶A、蛋白酶B、蛋白酶C（均由枯草芽孢桿菌表達，水解度不同），以及胰蛋白酶、風味蛋白酶5 種蛋白酶均由寧夏夏盛實業集團有限公司生產；甲醛、氫氧化鈉、鹽酸、無水硫酸銅、三氯乙酸、硼酸、硫酸，均為國產分析純；19 種氨基酸混合標準溶液，由北京索萊寶科技有限公司生產；乙腈、亮氨酸、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（多肽分析所用標準品）、血管緊張素Ⅱ、阿太地爾、細胞色素C，由上海阿拉丁生化科技股份有限公司生產。

1.2 實驗方法

1.2.1 血粉酶解工藝

將血粉與純化水按照一定比例混合后，用氫氧化鈉溶液調節料液pH，加入一定量的蛋白酶，在規定的溫度下恒溫攪拌酶解一定時間，酶解結束后于90 ℃水浴鍋中滅酶15 min，冷卻，測定蛋白水解度、酶解液氨基酸含量等指標。分別考察液料比、原料預處理溫度、蛋白酶種類及組合酶比例對血粉酶解效果的影響。

1.2.2 組合酶水解工藝

在確定組合酶比例的基礎上進一步優化血粉酶解工藝，以溫度、酶制劑添加量、pH 和時間為因素，以血粉蛋白水解度為指標，采用L9（34）正交實驗優化組合酶水解血粉工藝。正交實驗因素水平設計見表1。

表1 L9（34）正交實驗因素水平

1.3 分析檢測

總氮含量測定：參照GB 5009.5—2016，采用凱氏定氮法測定［10］。

水解度測定：稱取酶解液4 g 置于10 mL 離心管中，再加入質量分數15%的三氯乙酸溶液4 mL，振蕩至均一，然后靜置30 min，再在轉速8 000 r/min的離心機中離心10 min。稱量上清液，并測定其總氮含量，計算水解度（水解度=上清液中總氮質量/酶解液中總氮質量）。

氨基酸含量測定：參照NY/T 1975—2010，采用柱前衍生-液相色譜儀法測定［11］。

多肽分布測定：參照GB/T 22492—2008，采用高效凝膠過濾色譜法測定［12］。

1.4 數據處理

正交實驗分析由SPSS V17 完成；圖由Origin 8.0（美國OriginLab公司）繪制。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 液料比對血粉酶解效果的影響

在蛋白酶C 添加量為1.0%、pH 為7.0、時間為8 h、溫度為50 ℃的條件下，研究液料比對血粉酶解效果的影響，結果見圖1。

圖1 液料比對血粉酶解效果的影響

由圖1a.可知，隨著血粉濃度降低，料液中蛋白質含量不斷下降。由圖1b.可知，當液料體積質量比在4～6 mL/g 范圍內，血粉蛋白質的水解度隨著血粉濃度降低而增加；液料體積質量比在6～8 mL/g范圍內，血粉蛋白質的水解度隨血粉濃度降低而降低。因此，選擇6 mL/g作為較佳的液料體積質量比（后續實驗液料體積質量比均為6 mL/g），此時料液中w（蛋白質）為12.50%。該實驗結果與復合蛋白酶在不同液料比條件下水解效果基本一致［13］。在酶促反應過程中，不同的底物濃度對酶制劑的酶解效果具有顯著影響［14］。研究表明，在一定范圍內，隨著底物濃度不斷增加，酶與底物結合達到飽和，底物濃度增加反應效率不再提高［15］，反而因底物濃度過大，降低酶在溶液中的擴散能力，而且過量底物可能通過分子間作用力與酶結合形成中間產物，抑制酶解反應的進行，使得蛋白水解度降低［16］。

2.1.2 原料預處理溫度對血粉酶解效果的影響

在蛋白酶C 添加量為1.0%、pH 為7.0、時間為8 h、溫度為50 ℃的條件下，探究了在不同預處理溫度下加熱10 min對血粉酶解效果的影響，結果見圖2。

圖2 原料預處理溫度對血粉酶解效果的影響

由圖2 可知，對照組（常溫）血粉蛋白水解度及酶解液w（氨基酸）分別為44.57%和3.41%；當預處理溫度為70、75 ℃時，血粉蛋白水解度及酶解液氨基酸含量結果與對照組相當；當預處理溫度為80～90 ℃時，血粉蛋白水解度及酶解液氨基酸含量有所增加，處理溫度為90 ℃時提高幅度最大，血粉蛋白水解度及酶解液w（氨基酸） 分別為46.13%和3.64%。

蛋白質在變性過程中，維系其空間結構的次級鍵被破壞，原有空間結構解體，分子由緊密球形結構變為松散的無特定空間結構的鏈狀［17］。原料在酶解前，通過物理加熱手段使蛋白質適當變性，釋放酶切位點，為后續高效酶解提供基礎［18］，熱處理能破壞蛋白質的二級、三級或四級結構，打開氫鍵、S—S 鍵及疏水鍵，使多肽鏈完全展開；由于分子結構松散，那些原來包藏在分子內部的易與酶發生作用的部位暴露出來，從而使蛋白水解酶的作用點大大增加，提高酶解速度；但若加熱過度，松散的多肽鏈又會由于S—S 鍵和疏水鍵的再生而結合更加緊密，反而阻礙酶對蛋白的水解作用［19］。劉元林［20］研究發現，對堿性蛋白酶而言，僅低溫短時預處理（75 ℃，5 min）可促進蛋白水解；對風味蛋白酶而言，除低溫長時預處理（75 ℃，15 min）蛋白水解度與空白組無顯著性差異外，其他處理水解度都顯著低于空白組。張婷等［21］利用多元線性回歸法優化出最佳熱變性條件，w（血紅蛋白）5%時40 ℃熱變處理2.5 h 后，酶解血紅蛋白制備亞鐵血紅素產率達到10.42 mg/mL，較未經熱變性處理提高了30.02%。

根據本研究結果可知，在一定溫度范圍內，隨著預處理溫度升高，血粉酶解效果有所提升，但是提升幅度不大，沒有顯著促進效果。在加熱過程中血塊熟化，完全失去流動性，不利于酶與蛋白接觸，并且會沾到容器壁，對設備攪拌功能要求較高，同時成本會上升。因此，不建議對原料進行熱變性處理。

2.1.3 蛋白酶種類對血粉酶解效果的影響

在蛋白酶添加量為1.0%、pH 為7.0、時間為8 h、溫度為50 ℃的條件下，研究蛋白酶A、蛋白酶B、蛋白酶C、胰蛋白酶、風味蛋白酶對血粉酶解效果的影響，結果見圖3。

圖3 蛋白酶種類對血粉酶解效果的影響

由圖3 可以看出，蛋白酶B 的水解效果最好，血粉蛋白水解度為49.36%，酶解液中w（氨基酸）為3.95%；與其他蛋白酶相比，風味蛋白酶在對血粉蛋白水解上表現一般，但是在提高酶解液中氨基酸含量上具有較明顯的作用，w（氨基酸）高達4.02%。風味蛋白酶主要以外切酶為主，在對蛋白質進行水解的同時，可以從多肽末端切下更多的氨基酸。因此，選擇蛋白酶B 和風味蛋白酶組合進行酶解研究。在酶促反應過程中，酶具有專一性，不同蛋白酶對蛋白質的酶切位點不一樣，因此蛋白酶的選擇對血粉的酶解效率至關重要［22］。組合酶的使用對提高蛋白質水解度，得到高質量產物有非常重要的意義，內切酶對提高水解度效果較理想，外切酶能將氨基端的氨基酸水解為游離氨基酸［23］。劉成梅等［24］建立中性蛋白酶和風味蛋白酶同步酶解鴨血蛋白工藝，得到的小分子肽無異味且苦味輕；江霞等［25］采用風味蛋白酶與胰酶同步添加酶解工藝，提高了豬血蛋白水解度，獲得更加豐富的小分子肽及游離氨基酸產物；于美娟等［26］研究結果表明，組合酶水解豬血紅蛋白效果優于單一酶水解效果，彌補了兩種酶單獨酶解時的不足。

2.1.4 組合酶比例對血粉酶解效果的影響

在蛋白酶添加總量為1.0%、pH 為7.0、時間為8 h、溫度為50 ℃的條件下，研究蛋白酶B 和風味蛋白酶質量比對血粉酶解效果的影響，結果見圖4。

圖4 m（蛋白酶B）∶m（風味蛋白酶）對血粉酶解效果的影響

由圖4 可以看出，一開始隨著風味蛋白酶占比提高，組合酶對血粉的水解效果提升，但隨著風味蛋白酶占比進一步提升，組合酶對血粉的水解效果反而下降。因此選擇m（蛋白酶B）∶m（風味蛋白酶）為2 ∶1進行后續研究。

2.2 組合酶水解血粉正交實驗結果

為提高血粉蛋白酶水解度，增加酶解液中氨基酸含量，在m（蛋白酶B）∶m（風味蛋白酶）為2∶1 的條件下，以溫度、酶制劑添加量、pH 和時間為因素，以血粉蛋白水解度為指標，正交實驗結果見表2。

表2 組合酶L9（34）正交實驗結果

由表2 可知，溫度對血粉蛋白酶解產生主要作用，其次是組合酶添加量、pH和時間。較佳酶解工藝參數為溫度55 ℃、組合酶添加量3.0%、pH 8.0、時間12 h，此時血粉蛋白水解度為67.26%。

2.3 血粉酶解液中游離氨基酸分析

采用液相色譜儀檢測最佳酶解條件下的酶解液中氨基酸種類與質量分數，結果見表3。

表3 最佳酶解條件下血粉酶解液中氨基酸檢測結果

由表3可知，血粉酶解液中共含有19種游離氨基酸。經計算，游離氨基酸總質量分數為6.39%，占總蛋白質的51.12%（酶解液中總蛋白質質量分數為12.50%）。酶解液中丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和賴氨酸的質量分數均在0.50%以上，蘇氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的質量分數均在0.30%以上。尤其是亮氨酸的質量分數高達0.79%，占料液總蛋白質的6.32%。

2.4 血粉酶解液中多肽分析

采用液相色譜儀檢測最佳酶解條件下所得酶解液中多肽分布，混合多肽標樣色譜圖及酶解液中多肽分布色譜圖分別見圖5、圖6，酶解液中多肽分子量分布見表4。

圖5 混合多肽標樣液相色譜圖

圖6 酶解液中多肽分布液相色譜圖

表4 酶解液中多肽分子量分布

由圖6 及表4 可知，酶解液中多肽分子量在1 046 Da 以下的占比達到99.59%，其中多肽分子量在451～1 046 Da 的占比為3.66%，在131～＜451 Da 的占比為35.77%，分子量小于131 Da 的產物（小肽、氨基酸等）占比達60.17%。

3 結論

血粉的最佳酶解工藝為液料體積質量比6 mL/g、溫度55 ℃、組合酶添加量3.0%、pH 8.0、時間12 h，其中組合酶中蛋白酶B與風味蛋白酶質量比為2∶1。在該工藝條件下，血粉蛋白水解度為67.26%，酶解液中19種游離氨基酸總質量分數為6.39%，分子量在1 046 Da以下的多肽占比達到99.59%。通過對血粉酶解工藝的優化，提高了血粉蛋白的水解度，增加酶解液中氨基酸含量。該酶解工藝時間短，效率高，操作簡單，易于工廠大規模生產，為蛋白酶酶解血液制備氨基酸水溶肥的過程控制及規模應用提供理論指導。