基于SDF-1/CXCR4軸探討補(bǔ)腎壯筋湯促進(jìn)小鼠BMSCs歸巢和保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的機(jī)制研究

黃艷峰，馬德尊，付長(zhǎng)龍，葉錦霞，黃云梅，李西海

1 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；

2 福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122；

3 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種以軟骨退變?yōu)橹饕±硖卣鳎绊懻麄€(gè)關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形及功能喪失的疾病［1］。由于軟骨組織缺乏神經(jīng)、血管等營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，一旦發(fā)生退變，便很難實(shí)現(xiàn)再生修復(fù)，致使KOA的有效治療嚴(yán)重受到阻礙［2］。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）因其具備成軟骨、成骨等多向分化的特點(diǎn)，被認(rèn)為是一種適用于骨組織工程學(xué)研究的種子細(xì)胞［3-4］。當(dāng)組織損傷后，BMSCs可通過(guò)歸巢的方式募集到損傷處參與修復(fù)［5-6］。其中，趨化因子在BMSCs 歸巢中起關(guān)鍵作用，尤其是基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）可通過(guò)與CXC 趨化因子受體4（cxc chemokine receptor type 4，CXCR4）結(jié)合形成SDF-1/CXCR4 趨化軸，被認(rèn)為是迄今為止動(dòng)員BMSCs歸巢最有效的趨化軸之一［7-8］。

當(dāng)組織受到損傷后，損傷部位上調(diào)的SDF-1 結(jié)合CXCR4 可有效動(dòng)員、趨化、引導(dǎo)BMSCs 募集至損傷處進(jìn)行再生修復(fù)［9-10］，其機(jī)制主要與動(dòng)員調(diào)控生長(zhǎng)因子、黏附分子、集落刺激因子、金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）等有關(guān)［11-12］。但在損傷晚期，體內(nèi)持續(xù)趨化能力會(huì)降低，難以引導(dǎo)足夠數(shù)量的BMSCs到達(dá)受損區(qū)域［13］，然而，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥治療可以激活SDF-1/CXCR4 趨化軸促進(jìn)BMSCs歸巢修復(fù)軟骨損傷［14］。

KOA 屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇，肝腎虧虛，則筋骨失榮，治宜補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)筋壯骨［15］。補(bǔ)腎壯筋湯最早出自清代《傷科補(bǔ)要》，具有補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)壯筋骨的功效［16］。BMSCs 是骨髓中主要細(xì)胞，屬于中醫(yī)“髓”范疇，腎精充足，則骨髓生化有源，骨堅(jiān)筋強(qiáng)；腎精匱乏，則骨髓化生無(wú)源，骨痿筋弱［17］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎壯筋湯對(duì)軟骨細(xì)胞具有保護(hù)作用，可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，抑制軟骨基質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡，有效緩解肝腎虧虛型KOA 癥狀，改善關(guān)節(jié)功能［18］。但目前補(bǔ)腎壯筋湯在促進(jìn)BMSCs 歸巢和保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨方面尚未報(bào)道。因此，本課題擬采用軟骨損傷模型模擬軟骨退變，通過(guò)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)證明補(bǔ)腎壯筋湯調(diào)控歸巢相關(guān)因子，促進(jìn)退變軟骨修復(fù)，為KOA的康復(fù)治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8 周齡SPF 級(jí)C57BL/6 雄性小鼠30 只，體質(zhì)量（25±5）g，用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；4周齡SPF級(jí)GFP C57BL/6雄性轉(zhuǎn)基因小鼠10 只，體質(zhì)量（20±5）g，用于提取原代BMSCs。所有動(dòng)物均購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［生產(chǎn)許可證：SCXK（滬）2022-0004］，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［使用許可證：SYXK（閩）2019-0007］，每籠5只飼養(yǎng)，12 h/12 h的光照/黑暗周期交替，21～22 ℃室溫飼養(yǎng)，本研究已通過(guò)福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過(guò)（審批號(hào)：FJTCM IACUC 2021046）。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

補(bǔ)腎壯筋湯中藥飲片購(gòu)自福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院中藥房，藥物組成：熟地黃12 g，當(dāng)歸12 g，山茱萸12 g，茯苓12 g，續(xù)斷12 g，杜仲10 g，白芍10 g，牛膝10 g，五加皮10 g，青皮5 g。藥物經(jīng)冷凝回流法提取制備成濃縮液。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑

異氟烷購(gòu)自深圳瑞沃德公司；4%多聚甲醛購(gòu)自北京賽國(guó)生物科技公司；HE 染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司；RNA 提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；蛋白提取試劑盒購(gòu)自上海碧云天有限公司；SDF-1、G-CSF、VEGF、GAPDH 抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam有限公司；CXCR4、NCAM-1抗體均購(gòu)自武漢Proteintech 公司；IgG（H＋L）HRP 購(gòu)自上海玉博生物科技有限公司；小鼠BMSCs 培養(yǎng)基購(gòu)自上海OriCell公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；CD105、CD44、CD34均購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司；RNAi-Easy-慢病毒購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因有限公司；MMP-2 抗體、熒光二抗均購(gòu)自美國(guó)CST有限公司。

1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器

小動(dòng)物micro-CT 購(gòu)自美國(guó)PerkinElmer 公司；RNA 定量系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientifi 公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀、電泳儀、全能型成像系統(tǒng)均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司；激光共聚焦顯微鏡購(gòu)自于德國(guó)蔡司公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自于美國(guó)BD 公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自于美國(guó)Thermo Fisher公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.1.1小鼠軟骨損傷模型制備及分組與干預(yù) 取8 周齡C57BL/6 雄性SPF 級(jí)小鼠30 只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分成假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)腎壯筋湯組，每組10 只，使用異氟烷麻醉后，除假手術(shù)組外，其余2 組采用環(huán)狀打孔法構(gòu)建軟骨損傷模型［19-20］。假手術(shù)組和模型組給予0.9%生理鹽水灌胃1 mL/（100 g·d），補(bǔ)腎壯筋湯組給予補(bǔ)腎壯筋湯灌胃1 mL/（100 g·d），3組均干預(yù)12周，1次/d。

2.1.2關(guān)節(jié)組織形態(tài)學(xué)觀(guān)察 ① micro-CT 觀(guān)察軟骨損傷情況：動(dòng)物麻醉后，仰臥膝關(guān)節(jié)伸直位固定，選擇90 kV 電壓，88 μA 電流，調(diào)整合適角度進(jìn)行CT平掃，結(jié)束后選擇Sub：4.788 mm 區(qū)間進(jìn)行局部放大處理，并在局部病損部位進(jìn)行矢狀位切片觀(guān)察。② HE 染色觀(guān)軟骨損傷情況：3 組膝關(guān)節(jié)用4%多聚甲醛固定24 h，經(jīng)EDTA-2Na 脫鈣4 周制備石蠟切片，按照HE 試劑盒步驟在蘇木精染色液中浸泡1 min，分化液清洗10 s，在蒸餾水中返藍(lán)10 min，伊紅染色液浸泡30 s，蒸餾水快速?zèng)_洗，乙醇脫水后封片。在顯微鏡下觀(guān)察各組軟骨組織病理學(xué)變化。

2.1.3關(guān)節(jié)組織中SDF-1 熒光表達(dá)情況 將關(guān)節(jié)組織切片經(jīng)脫蠟處理后，依次進(jìn)行檸檬酸鈉抗原高溫修復(fù)，0.5%曲拉通透膜，5%BSA 封閉30 min，滴加SDF-1（1∶200）抗體過(guò)夜孵育，清洗后滴加熒光同源二抗IgG Fab2（555）（1∶1 000）孵育，激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察3組細(xì)胞SDF-1熒光表達(dá)情況。

2.1.4補(bǔ)腎壯筋湯干預(yù)后歸巢關(guān)鍵調(diào)控因子的變化 ① qPCR 檢測(cè)SDF-1、CXCR4、MIP-1α、MCP-1、MIP-1β、RANTES、VEGF、G-CSF、NCAM-1、MMP-2的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平：按RNA 提取試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟，將提取的組織總RNA 上機(jī)檢測(cè)RNA 純度與濃度；按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟配制逆轉(zhuǎn)錄體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；按照Hiscript?Ⅱ試劑盒步驟，提前合成相關(guān)基因引物并按照說(shuō)明書(shū)配成10 μmol/L，引物序列見(jiàn)表1，熱循環(huán)條件按：94 ℃，5 min；94 ℃，10 s；55℃，15 s；72 ℃，10 s 循環(huán)32 次；72 ℃，5 min；以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔct計(jì)算各目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平。② Western blot 檢測(cè)SDF-1、CXCR4、GCSF、VEGF、NCAM-1、MMP-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量：提取3組軟骨組織總蛋白后按BCA定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，配制10%分離膠進(jìn)行電泳，400 mA恒流、4 ℃轉(zhuǎn)膜，常溫封閉2 h，一抗GAPDH（1∶5 000）、SDF-1（1∶1 000）、CXCR4（1∶1 000）、G-CSF（1∶1 000）、VEGF（1∶1 000）、NCAM-1（1∶5 000）、MMP-2（1∶1 000）4 ℃過(guò)夜敷育，次日二抗IgG（H＋L）HRP 二抗（1∶5 000）常溫孵育1 h，滴加ECL 化學(xué)發(fā)光液于凝膠成像系統(tǒng)拍照，Image Lab軟件定量分析條帶灰度值。

表1 相關(guān)基因引物序列Table 1 Related gene primer sequences

2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

2.2.1BMSCs 的提取與鑒定 采用全骨髓貼壁法［21］提取BMSCs，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第2 代BMSCs制成單細(xì)胞懸液；PBS 洗滌后，依次加入CD105、CD44、CD34 抗體，4 ℃孵育30 min；離心后PBS 再次洗滌后于流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)BMSCs陽(yáng)性率。

2.2.2SDF-1慢病毒轉(zhuǎn)染 第2代BMSCs 待細(xì)胞密度達(dá)到40%～60%時(shí)再加入慢病毒懸液，感染復(fù)數(shù)（MOI）設(shè)為10、50、100、150，低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h后更換為小鼠骨髓間充質(zhì)BMSCs 培養(yǎng)基，72 h 后將6 孔板置于熒光顯微鏡下觀(guān)察熒光表達(dá)情況，以熒光強(qiáng)度覆蓋80%，且不影響細(xì)胞形態(tài)為佳，轉(zhuǎn)染成功后的細(xì)胞在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)綠色熒光。

2.2.3細(xì)胞分組與干預(yù) 取第2代BMSCs隨機(jī)分為空白組、空載組、補(bǔ)腎壯筋湯組、sh-SDF-1 組、sh-SDF-1＋補(bǔ)腎壯筋湯組5 組。空白組和空載組予以小鼠BMSCs 培養(yǎng)基培養(yǎng)，空載組同時(shí)加入空載病毒；補(bǔ)腎壯筋湯組予以BMSCs 完全培養(yǎng)基＋補(bǔ)腎壯筋湯200 μg/mL；sh-SDF-1 組予以BMSCs 完全培養(yǎng)基＋SDF-1 慢病毒；sh-SDF-1 組＋補(bǔ)腎壯筋湯組予以BMSCs 完全培養(yǎng)基＋SDF-1 慢病毒＋補(bǔ)腎壯筋湯200 μg/mL；參照前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，每組均干預(yù)8 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)［22］。

2.2.4劃痕實(shí)驗(yàn)觀(guān)察5 組BMSCs 遷移能力 將第2 代細(xì)胞懸液按1×105/mL 濃度均勻鋪到6 孔板中，在37 ℃含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用100 μL槍頭以6 孔板的板蓋或者直尺為媒介每孔均勻劃5 條直線(xiàn)，PBS清洗后按照“2.2.3”所述進(jìn)行干預(yù)，光學(xué)顯微鏡下拍照并記錄。

2.2.5阿利新藍(lán)和免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)5組成軟骨分化能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按照1×105/mL的細(xì)胞密度接種至6 孔板中，按照“2.2.3”所述進(jìn)行干預(yù)后，每2～3 d 更換成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)約3周。① 阿利新藍(lán)染色：細(xì)胞經(jīng)PBS 清洗后，滴加A 試劑室溫反應(yīng)30 min，流水洗滌5 min，滴加試劑B 室溫反應(yīng)10 min，流水洗滌1 min 后脫水封片，比較5 組陽(yáng)性表達(dá)率。② Collagen Ⅱ免疫細(xì)胞化學(xué)染色：4%多聚甲醛室溫固定、0.5% Triton 室溫通透、3%H2O2室溫孵育、5% BSA 室溫封閉、Collagen Ⅱ抗體孵育（1∶200），4 °C過(guò)夜、二抗室溫反應(yīng)、DAB 室溫浸潤(rùn)顯色、蘇木素復(fù)染30 s、PBS 返藍(lán)處理、脫水封片后，比較5組Collagen Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.2.6檢測(cè)補(bǔ)腎壯筋湯對(duì)歸巢關(guān)鍵調(diào)控因子的影響 ① 激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察5 組SDF-1、CXCR4熒光表達(dá)情況：細(xì)胞干預(yù)結(jié)束后，加入4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS 清洗，加入0.5%曲拉通透膜，5%BSA 血清封閉，加入SDF-1、CXCR4 熒光蛋白抗體過(guò)夜孵育（1∶200），熒光二抗IgG Fab2（555、488）（1∶1 000）結(jié)合反應(yīng)，PBS清洗，共聚焦顯微鏡下觀(guān)察各組細(xì)胞SDF-1、CXCR4 熒光表達(dá)情況。② qPCR檢測(cè)5 組SDF-1、CXCR4、G-CSF、VEGF、NCAM-1、MMP-2 的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平：提取的細(xì)胞總RNA 上機(jī)檢測(cè)RNA 純度與濃度；參照“2.1.5”實(shí)驗(yàn)步驟及引物序列，置于7500 Fast PCR儀上機(jī)檢測(cè)。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 26.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布的用（±s）表示，數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布的則采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示。采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，若組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則進(jìn)一步采用LSD-t法或Games-Howell 法進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 3組關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)學(xué)比較

micro-CT 顯示：假手術(shù)組股骨關(guān)節(jié)面光滑平整，骨皮質(zhì)完整，弧度圓潤(rùn)，HE 染色見(jiàn)軟骨細(xì)胞排列有序；與假手術(shù)組對(duì)比，模型組股骨髁間可見(jiàn)一圓形缺損，骨皮質(zhì)缺損失連（紅色箭頭標(biāo)記處），HE染色見(jiàn)軟骨細(xì)胞缺失；與模型組對(duì)比，補(bǔ)腎壯筋湯組股骨髁間環(huán)形缺損較小，大部分骨皮質(zhì)連接正常，但仍有部分失連，軟骨細(xì)胞稍紊亂。見(jiàn)圖1。

圖1 3組軟骨損傷修復(fù)情況比較（×200）Figure 1 Comparison of three groups of cartilage injury repair (×200)

3.2 3組關(guān)節(jié)軟骨SDF-1熒光強(qiáng)度比較

與假手術(shù)組對(duì)比，模型組損傷處軟骨細(xì)胞缺失嚴(yán)重，排列紊亂，SDF-1 的熒光蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與模型組對(duì)比，補(bǔ)腎壯筋湯組軟骨細(xì)胞增多，排列稍紊亂，SDF-1 的熒光蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 3組關(guān)節(jié)軟骨SDF-1熒光強(qiáng)度比較（×200）Figure 2 Comparison of fluorescence intensity of SDF-1 in three groups of articular cartilage (×200)

3.3 3 組關(guān)節(jié)軟骨損傷中歸巢相關(guān)調(diào)控因子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平比較

與假手術(shù)組對(duì)比，模型組趨化因子SDF-1、CXCR4、MIP-1α、MCP-1、MIP-1β、RANTES、生長(zhǎng)因子VEGF、集落刺激因子G-CSF、黏附分子NCAM-1、基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2 的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平升高（P＜0.05）；與模型組對(duì)比，補(bǔ)腎壯筋湯組SDF-1、CXCR4、MIP-1α、MCP-1、MIP-1β、RANTES、VEGF、G-CSF、NCAM-1、MMP-2的mRNA轉(zhuǎn)錄水平升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 3組歸巢相關(guān)調(diào)控因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平比較Figure 3 Comparison of mRNA transcription level of three homing related regulatory factors

3.4 3 組關(guān)節(jié)軟骨歸巢相關(guān)因子蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

與假手術(shù)組比較，模型組趨化因子SDF-1、CXCR4、集落刺激因子G-CSF、生長(zhǎng)因子VEGF、黏附分子NCAM-1、基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2的蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）；與模型組比較，補(bǔ)腎壯筋湯組SDF-1、CXCR4、G-CSF、VEGF、NCAM-1、MMP-2 的蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 3組歸巢相關(guān)調(diào)控因子蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Figure 4 Comparison of protein expression level of three homing related regulatory factors

4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1 BMSCs鑒定及慢病毒轉(zhuǎn)染情況

第2代BMSCs經(jīng)細(xì)胞流式術(shù)鑒定：CD105、CD44呈陽(yáng)性表達(dá)，CD34 呈陰性表達(dá)。見(jiàn)圖5A。慢病毒MOI 值為100 時(shí)，SDF-1 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的第2 代BMSCs感染效率最高，且細(xì)胞狀態(tài)未受到明顯影響，在雙轉(zhuǎn)盤(pán)激光共聚焦顯微鏡下可觀(guān)察到較強(qiáng)的綠色熒光。見(jiàn)圖5B。

圖5 BMSCs鑒定及慢病毒轉(zhuǎn)染情況（×100）Figure 5 Identification of BMSCs and lentivirus transfection status (×100)

4.2 5組BMSCs遷移能力比較

與空白組比較，sh-SDF-1組細(xì)胞向劃痕區(qū)域遷移的細(xì)胞數(shù)量顯著減少，而補(bǔ)腎壯筋湯組細(xì)胞遷移數(shù)量顯著增多；與sh-SDF-1 組比較，補(bǔ)腎壯筋湯組和sh-SDF-1＋補(bǔ)腎壯筋湯組細(xì)胞遷移數(shù)量顯著增多。見(jiàn)圖6。

圖6 5組BMSCs遷移能力比較（×100）Figure 6 Comparison of migration ability in five groups of BMSCs (×100)

4.3 5組BMSCs成軟骨分化能力比較

與空白組比較，sh-SDF-1 組酸性黏多糖和CollagenⅡ蛋白表達(dá)顯著減少，而補(bǔ)腎壯筋湯組酸性黏多糖和CollagenⅡ蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)（P＜0.05）；與sh-SDF-1 組比較，補(bǔ)腎壯筋湯組和sh-SDF-1＋補(bǔ)腎壯筋湯組酸性黏多糖和CollagenⅡ蛋白表達(dá)均顯著增強(qiáng)（P＜0.05）。見(jiàn)圖7。

圖7 5組BMSCs的成軟骨分化能力比較（×100）Figure 7 Comparison of chondrogenic differentiation ability in five groups of BMSCs (×100)

4.4 5組BMSCs中SDF-1、CXCR4熒光強(qiáng)度比較

與空白組對(duì)比，sh-SDF-1 組SDF-1、CXCR4 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），補(bǔ)腎壯筋湯組的SDF-1、CXCR4 蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)（P＜0.05）；與sh-SDF-1組對(duì)比，補(bǔ)腎壯筋湯組和sh-SDF-1＋補(bǔ)腎壯筋湯組的SDF-1、CXCR4 蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)（P＜0.05）。見(jiàn)圖8。

4.5 5 組BMSCs 中歸巢相關(guān)調(diào)控因子的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平比較

與空白組對(duì)比，sh-SDF-1 組趨化因子SDF-1、CXCR4、集落因子G-CSF、生長(zhǎng)因子VEGF、黏附分子NCAM-1、基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2 的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平降低（P＜0.05），而補(bǔ)腎壯筋湯組SDF-1、CXCR4、G-CSF、VEGF、NCAM-1、MMP-2 的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平升高（P＜0.05）；與sh-SDF-1 組對(duì)比，補(bǔ)腎壯筋湯組和sh-SDF-1＋補(bǔ)腎壯筋湯組的SDF-1、CXCR4、G-CSF、VEGF、NCAM-1、MMP-2 的mRNA轉(zhuǎn)錄水平升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖9。

圖9 5組BMSCs中歸巢相關(guān)調(diào)控因子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平比較Figure 9 Comparison of mRNA transcription level of homing related regulatory factors in five groups of BMSCs

5 討 論

本研究從動(dòng)物影像學(xué)和形態(tài)學(xué)層面證明了補(bǔ)腎壯筋湯可促進(jìn)軟骨缺損修復(fù)，并與趨化軸調(diào)控的歸巢關(guān)鍵因子有關(guān)；繼而對(duì)BMSCs 趨化軸關(guān)鍵基因——SDF-1 基因進(jìn)行慢病毒敲減，結(jié)果顯示，SDF-1基因敲減后BMSCs 遷移、成軟骨分化及歸巢能力一致降低，但通過(guò)補(bǔ)腎壯筋湯干預(yù)后可逆轉(zhuǎn)這些現(xiàn)象。這些結(jié)果表明，補(bǔ)腎壯筋湯可通過(guò)調(diào)控趨化軸促進(jìn)BMSCs歸巢修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷，可為KOA的康復(fù)治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

5.1 補(bǔ)腎壯筋湯促進(jìn)BMSCs修復(fù)KOA軟骨退變

KOA 屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇，與肝、腎關(guān)系密切，補(bǔ)腎壯筋湯出自清代《傷科補(bǔ)要》，具有補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)壯筋骨功效［16］，全方以山茱萸、熟地黃為君藥，陰陽(yáng)互補(bǔ)，補(bǔ)腎柔肝、強(qiáng)筋骨；佐以杜仲、續(xù)斷、五加皮祛風(fēng)濕、強(qiáng)筋骨；白芍?jǐn)筷幒蜖I(yíng)、柔肝止痛，當(dāng)歸補(bǔ)血活血，青皮行氣疏肝，茯苓健脾和胃、化痰除濕；牛膝補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)筋壯骨、活血通經(jīng)，引藥下行，直達(dá)病所，諸藥合用標(biāo)本兼治，共奏補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)壯筋骨的功效。而B(niǎo)MSCs 源于骨髓腔，與肝、腎關(guān)系密切，相關(guān)學(xué)者認(rèn)為肝、腎精血是BMSCs 的物質(zhì)基礎(chǔ)，通過(guò)滋補(bǔ)肝腎的方式可促進(jìn)BMSCs 的增殖分化［23］。本研究采用軟骨缺損模型模擬KOA 軟骨退變剝脫，通過(guò)micro-CT 及HE 驗(yàn)證了補(bǔ)腎壯筋湯可促進(jìn)軟骨退變的修復(fù)，同時(shí)通過(guò)劃痕及成軟骨分化實(shí)驗(yàn)證明了補(bǔ)腎壯筋湯可促進(jìn)BMSCs 的遷移和成軟骨分化能力。因此，軟骨退變的修復(fù)主要與補(bǔ)腎壯筋湯促進(jìn)了BMSCs功能有關(guān)。

5.2 補(bǔ)腎壯筋湯上調(diào)SDF-1/CXCR4 軸促進(jìn)BMSCs歸巢

在正常情況下，骨髓和BMSCs 維持著一種動(dòng)態(tài)平衡，即少量BMSCs 不斷離開(kāi)骨髓，巡回在外周組織，大多數(shù)BMSCs 在體內(nèi)骨髓腔微環(huán)境中保持相對(duì)靜止，直到機(jī)體遭受損傷需要更多細(xì)胞來(lái)維持組織功能而被激活［24］。在損傷后，BMSCs 會(huì)主動(dòng)退出生態(tài)位，在趨化因子等的驅(qū)動(dòng)下，募集歸巢到損傷處并廣泛增殖、自我更新和分化，以再生丟失的組織，但面對(duì)修復(fù)時(shí)間較長(zhǎng)的損傷，其歸巢再生能力往往不足［25］。研究表明，有效動(dòng)員SDF-1/CXCR4 趨化軸可有效引導(dǎo)BMSCs 募集至損傷處進(jìn)行再生修復(fù)［9-10］。當(dāng)BMSCs 被調(diào)動(dòng)并遷移到損傷部位后，需要BMSCs 表達(dá)細(xì)胞黏附分子與細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的黏附分子配體相結(jié)合，通過(guò)在血管內(nèi)皮細(xì)胞上附著遷移，加上MMPs協(xié)助分解基底膜進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，并利用集落因子、生長(zhǎng)因子等協(xié)同作用，完成BMSCs在受損部位的定植［26］。

本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎壯筋湯可促進(jìn)損傷區(qū)域CXC 趨化因子SDF-1 蛋白表達(dá)，接著進(jìn)一步檢測(cè)了SDF-1 及受體CXCR4 和歸巢密切相關(guān)的CXC 趨化因子家族中同類(lèi)型配體MIP-1α、MCP-1、RANTES、CC 趨化因子家族中配體MIP-1β，生長(zhǎng)因子VEGF、集落刺激因子G-CSF、黏附分子NCAM-1及金屬蛋白酶MMP-2 的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果呈現(xiàn)一致性升高，并通過(guò)蛋白進(jìn)一步驗(yàn)證得到了同樣的結(jié)果。基于此，進(jìn)而細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)BMSCs 進(jìn)行SDF-1 慢病毒敲減，結(jié)果表明：補(bǔ)腎壯筋湯可逆轉(zhuǎn)SDF-1 基因敲減后的SDF-1、CXCR4、VEGF、G-CSF、NCAM-1、MMP-2 的mRNA 和蛋白表達(dá)。綜上，本實(shí)驗(yàn)證明補(bǔ)腎壯筋湯可通過(guò)上調(diào)SDF-1/CXCR4 軸促進(jìn)小鼠BMSCs 歸巢來(lái)修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨退變。但本研究結(jié)果只停留在表觀(guān)層面，仍具有許多局限，如機(jī)制層面深入不足，補(bǔ)腎壯筋湯具體是哪些成分起的修復(fù)作用，SDF-1/CXCR4 趨化軸促進(jìn)BMSCs 歸巢后通過(guò)什么渠道實(shí)現(xiàn)軟骨退變修復(fù)，以及補(bǔ)腎壯筋湯藥物濃度設(shè)計(jì)不足等方面還有待后續(xù)進(jìn)一步研究。