吉蘭-巴雷綜合征患者外周血記憶性T細胞和記憶性B細胞亞群的變化及其臨床意義

劉壇 黃小雨 張勇

[摘要]?目的?探討吉蘭-巴雷綜合征（Guillain-Barré?syndrome，GBS）患者外周血記憶性T細胞和記憶性B細胞亞群的變化及其臨床意義。方法?選取2018年6月至2020年12月于徐州醫科大學附屬醫院神經內科住院的16例GBS患者作為研究組，并選取同期16名來院的健康體檢者作為對照組。流式細胞術檢測兩組入選者的外周血T細胞亞群，包括CD4+初始T細胞（naive?T?cells，TN）、CD4+中央記憶性T細胞（central?memory?T?cells，TCM）、CD4+效應記憶性T細胞（effector?memory?T?cells，TEM）和CD4+終末分化效應記憶性T細胞（terminally?differentiated?effector?memory?T?cells，TEMRA）及記憶性B細胞、漿母細胞的占比并分析其臨床價值。結果?與對照組相比，研究組患者的CD4+TN及CD8+TN均明顯下降（P<0.05），CD4+TEM及CD8+TEM均明顯升高（P<0.05），TCM及TEMRA在CD4和CD8上的比例比較，差異無統計學意義（P>0.05）。與對照組相比，研究組記憶性B細胞比例明顯升高（P<0.05），兩組患者間漿母細胞占比比較，差異無統計學意義（P>0.05）。GBS患者外周血CD4+TEM及CD8+TEM占比與Hughes殘疾評分、腦脊液蛋白、腦脊液免疫球蛋白G及記憶性B細胞占比均呈正相關（P<0.05）。結論?GBS患者存在記憶性T細胞和記憶性B細胞亞群免疫紊亂，CD4+TEM細胞、CD8+TEM細胞及記憶性B細胞占比升高，這很可能是GBS發病過程中重要的外周免疫機制。

[關鍵詞]?吉蘭-巴雷綜合征；效應記憶性T細胞；記憶性B細胞

[中圖分類號]?R743.3??????[文獻標識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2024.06.013

Changes?and?clinical?significance?of?memory?T?cells?and?memory?B?cell?subsets?in?peripheral?blood?of?patients?with?Guillain-Barré?syndrome

LIU?Tan1，?HUANG?Xiaoyu2，?ZHANG?Yong2

1.Department?of?Neurology，?the?First?Peoples?Hospital?of?Huzhou，?Huzhou?313000，?Zhejiang，?China;?2.Department?of?Neurology，?Affiliated?Hospital?of?Xuzhou?Medical?University，?Xuzhou?221000，?Jiangsu，?China

[Abstract]?Objective?To?investigate?the?changes?of?memory?T?cells?and?memory?B?cells?subsets?in?peripheral?blood?of?patients?with?Guillain-Barré?syndrome?（GBS）?and?their?clinical?significance.?Methods?A?total?of?16?patients?with?GBS?who?were?hospitalized?in?the?Department?of?Neurology，?Affiliated?Hospital?of?Xuzhou?Medical?University?from?June?2018?to?December?2020?were?selected?as?the?research?group，?and?16?healthy?people?who?came?to?the?hospital?for?physical?examination?during?the?same?period?were?selected?as?the?control?group.?The?proportion?of?CD4+?naive?T?cells?（TN），?CD4+?central?memory?T?cells?（TCM），?CD4+?effector?memory?T?cells?（TEM），?CD4+?terminally?differentiated?effector?memory?T?cells?（TEMRA），?memory?B?cells?and?plasmacytocytes?in?peripheral?blood?of?the?two?groups?was?detected?by?flow?cytometry?and?its?clinical?value?was?analyzed.?Results?Compared?with?the?control?group，?CD4+TN?and?CD8+TN?were?significantly?decreased?in?research?group?（P<0.05），?while?CD4+TEM?and?CD8+TEM?were?significantly?increased?in?research?group?（P<0.05）.?There?was?no?significant?difference?between?TCM?and?TEMRA?in?the?proportion?of?CD4?and?CD8?（P>0.05）.?Compared?with?the?control?group，?the?proportion?of?memory?B?cells?in?the?GBS?group?was?significantly?increased?（P<0.05），?while?the?proportion?of?plasmabytes?was?not?significantly?different.?The?percentages?of?CD4+TEM?and?CD8+TEM?in?peripheral?blood?of?GBS?patients?were?positively?correlated?with?Hughes?disability?score，?cerebrospinal?fluid?protein，?cerebrospinal?fluid?immunoglobulin?G?and?memory?B?cells?（P<0.05）.?Conclusion?There?are?immune?disorders?of?memory?T?cells?and?memory?B?cells?subsets?in?patients?with?GBS.?The?increased?proportion?of?CD4+TEM?cells，?CD8+TEM?cells?and?memory?B?cells?may?be?a?peripheral?immune?mechanism?in?the?pathogenesis?of?GBS.

[Key?words]?Guillain-Barré?syndrome;?Effector?memory?T?cells;?Memory?B?cells

吉蘭-巴雷綜合征（Guillain-Barré?syndrome，GBS）是一類免疫介導的急性炎性周圍神經病，主要病理生理機制是外周神經中抗體-抗原相互作用引起的補體介導的神經損傷[1-2]。既往研究發現體液免疫及細胞免疫共同參與此病的發生，然而國內外關于GBS免疫細胞亞群的研究尚不充分，尤其是記憶性細胞亞群在GBS患者外周血中的占比仍需進一步探討。已有文獻報道記憶性B細胞參與了GBS的發病[3]；也有學者指出記憶性T細胞可幫助記憶性B細胞更快速地產生抗體反應[4]。由此推測記憶性T細胞及記憶性B細胞均可能參與GBS的發病。本研究通過分析GBS患者記憶性T細胞及記憶性B細胞亞群的改變，為探索GBS的發病機制提供新思路。

1??資料與方法

1.1??一般資料

回顧性選取2018年6月至2020年12月于徐州醫科大學附屬醫院神經內科住院的16例GBS患者作為研究組，其中男8例、女8例，年齡28～78歲，平均（54.38±15.24）歲。選取同期16名來院的健康體檢者作為對照組，其中男7例、女9例，年齡29～69歲，平均（46.56±11.18）歲。納入標準：①符合《中國吉蘭-巴雷綜合征診治指南2019》診斷標準[1]；②年齡≥18歲；③未接受靜脈注射免疫球蛋白治療。排除標準：①其他自身免疫性疾病，如白血病、類風濕疾病、甲狀腺疾病、人類免疫缺陷病毒感染的患者；②器官移植的患者；③診斷不明確或臨床資料不全、資料丟失的患者。所有研究對象均簽署知情同意書。本研究經徐州醫科大學附屬醫院倫理委員會審批通過（倫理審批號：XYFY2020-JS019-01）。

1.2??方法

所有研究對象均于入組后空腹抽取6ml靜脈血，其中2ml靜脈血用乙二胺四乙酸（ethylene?diamine?tetraacetic?acid，EDTA）抗凝，余靜脈血不抗凝直接分離血清。采用人淋巴細胞分離液（天津灝洋生物公司）分離得到外周血單個核細胞（peripheral?blood?mononuclear?cell，PBMC），經磷酸緩沖鹽溶液（phosphate?buffer?saline，PBS）洗滌離心后加入鼠抗人CD3-APC-Cy7抗體、鼠抗人CD4-APC抗體、鼠抗人CD8-Percp-Cy5-5抗體、鼠抗人CD45RA-?V450抗體、鼠抗人CCR7-BV510抗體（美國BD公司）；同時設同型對照管，室溫避光孵育15min后，流式細胞儀檢測記憶性T細胞亞群，其中CD4+初始T細胞（naive?T?cells，TN）表型為CD3+、CD4+、CD8-CD45RA+、CCR7+，CD4+中央記憶性T細胞（central?memory?T?cells，TCM）表型為CD3+、CD4+、CD8-CD45RA-、CCR7+，CD4+效應記憶性T細胞（effector?memory?T?cells，TEM）表型為CD3+、CD4+、CD8-CD45RA-、CCR7-，CD4+終末分化效應記憶性T細胞（terminally?differentiated?effector?memory?T?cells，TEMRA）表型為CD3+、CD4+、CD8-CD45RA-、CCR7-；CD8+TN細胞表型為CD3+、CD4-、CD8+?CD45RA+、CCR7+，CD8+TCM細胞表型為CD3+、CD4-、CD8+CD45RA-、CCR7+，CD8+TEM細胞表型為CD3+、CD4-、CD8+CD45RA-、CCR7-，CD8+TEMRA細胞表型為CD3+、CD4-、CD8+?CD45RA-、CCR7-。在分離的PBMC中加入鼠抗人CD45-Percp-Cy5-5抗體、鼠抗人CD19-APC、鼠抗人CD27-?BV510、鼠抗人CD38-FITC抗體（美國BD公司），同時設同型對照管。室溫避光孵育15min后，流式細胞儀檢測記憶B細胞亞群，其中記憶B細胞表型為CD19+?CD27+，漿母細胞表型為CD19+?CD27+CD38+。

1.3??統計學方法

采用SPSS?19.0統計學軟件對數據進行處理分析。符合正態分布的計量資料用均數±標準差（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。不符合正態分布的計量資料以中位數（四分位數間距）[M（Q1，Q3）]表示，組間比較采用秩檢驗。計數資料以例數（百分率）[n（%）]表示，組間比較采用c2檢驗。采用Pearson相關性分析CD4+TEM及CD8+TEM占比與Hughes殘疾評分、腦脊液蛋白、腦脊液免疫球蛋白G（immunoglobulin?G，IgG）及記憶性B細胞的相關性。P<0.05為差異有統計學意義。

2??結果

2.1??GBS患者的一般資料及外周血記憶性T細胞亞群占比分析

GBS患者的一般資料分析見表1。與對照組相比，研究組患者的CD4+TN及CD8+TN均明顯下降（P<0.05），CD4+TEM及CD8+TEM均明顯升高（P<0.05），TCM及TEMRA在CD4和CD8上的比例差異無統計學意義（P>0.05），見表2。

2.2??兩組患者的外周血記憶性B細胞占比比較

與對照組比較，研究組患者的記憶性B細胞比例明顯升高（P<0.05），漿母細胞的比例差異無統計學意義，見表3。

2.3??GBS患者外周血CD4+TEM和CD8+TEM占比與GBS患者臨床嚴重程度的相關性分析

GBS患者外周血CD4+TEM及CD8+TEM占比與Hughes殘疾評分、腦脊液蛋白、腦脊液IgG及記憶性B細胞占比均呈正相關（P<0.05），見圖1。

3??討論

GBS發病與自身免疫功能障礙相關，各種類型的活化的T細胞被認為是GBS的發生和發展的協調者。研究表明記憶性T細胞對B細胞生發中心的形成及產生對抗髓鞘的抗體具有十分重要的作用，其中TEM細胞可通過產生細胞因子白細胞介素（interleukin-17，IL-17）和重組人干擾素（recombinant?human?interferon-r，IFN-γ）等炎癥因子參與B細胞的分化[5]；同時記憶性B細胞也與GBS的發病相關[3]。因此，進一步明確記憶性B細胞亞群、記憶性T細胞亞群尤其是TEM細胞在GBS患者外周血中的占比，對解釋GBS的發病機制至關重要。

有學者根據是否表達CD45RA區別初始T細胞和記憶性T細胞，并進一步依據趨化因子受體CCR7的表達將記憶性T細胞分為TCM和TEM[6]。與初始T細胞和TCM細胞相比，TEM細胞更能快速被抗原識別，迅速激活免疫反應，且可立刻到達炎癥部位并發揮作用[7]。既往多項研究表明，TEM細胞與一些自身免疫性疾病如多發性硬化、系統性紅斑狼瘡?、結腸炎、1型糖尿病等的發生、發展、復發及嚴重程度密切相關[8-12]。本研究結果也顯示，與對照組相比，研究組患者外周血CD4+TEM細胞和CD8+TEM細胞占比更高，差異有統計學意義。初始B細胞成熟后，與抗原相遇被其激活，隨后分化為CD19+CD27+記憶性B細胞；當記憶性B細胞再次與相同抗原相遇時就會增殖，分化為漿細胞，產生特異性抗體，從而發揮介導體液免疫應答的作用。據報道，記憶性B細胞在一些自身免疫性疾病如系統性紅斑狼瘡、類風濕關節炎、自身免疫性溶血性貧血等疾病中發揮至關重要的作用[13-15]。Wang等[3]發現記憶B細胞在GBS急性期顯著增加，并隨著病情的恢復而減少，進一步的Spearman相關分析顯示GBS的臨床嚴重程度與患者外周血中記憶B細胞的占比呈正相關。本研究結果與之一致，研究組患者記憶性B細胞比例高于對照組；此外，進一步Pearson相關性分析顯示CD4+TEM及CD8+TEM細胞占比與Hughes殘疾評分、腦脊液蛋白、腦脊液IgG及記憶性B細胞占比均呈正相關，CD4+TEM及CD8+TEM細胞與疾病臨床嚴重程度呈正相關。在GBS發病中發揮重要作用，并可能通過自身效應功能調節B細胞的分化參與GBS的發病。

綜上，本研究發現GBS患者存在記憶性T細胞和記憶性B細胞亞群免疫紊亂，外周血中CD4+TEM細胞、CD8+TEM細胞及記憶性B細胞占比升高可能是GBS發病過程中的一個外周免疫機制。進一步深入探討TEM細胞參與GBS發病的機制有望成為治療GBS的新靶點。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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