炎癥小體在代謝性疾病中研究進展

李瑞琳 蔡偉

(南昌大學江西醫學院,江西 南昌 330006)

先天免疫系統是人體防御的第一道防線,編碼模式識別受體(PRRs)在對有害刺激(如入侵病原體、死亡細胞或環境刺激物)做出反應時,先天免疫系統被激活〔1〕。模式識別受體能夠識別入侵微生物中的病原體相關分子模式(PAMPs)和宿主來源的損傷相關分子模式(DAMPs),成為防止感染和組織損傷的第一道防線〔2〕。2002年首次詳細報道的一種新發現的PRRs是炎癥體,它是一種高分子量的蛋白質復合物,能夠招募和激活胱天蛋白酶(caspase)-1〔3〕。活化的caspase-1切割白細胞介素(IL)-1β和IL-18的前體,促進細胞因子IL-1β和IL-18的成熟和分泌,參與炎癥過程,誘導細胞焦亡。代謝性疾病是指在體內生物化學過程發生障礙時,某些代謝物質如糖、脂肪、蛋白質、嘌呤、鈣、銅等堆積或缺乏而引起的疾病,包括糖尿病(DM)、痛風、肥胖、動脈粥樣硬化(AS)等。炎癥是代謝綜合征的重要組成部分。炎性小體的激活導致肝臟、肌肉和脂肪組織的外周胰島素抵抗;促進中樞性瘦素/胰島素抵抗,破壞下丘腦能量平衡的神經元控制;損害胰島胰島素分泌;促進血管壁動脈粥樣硬化的發生〔4〕。現就炎癥小體與代謝性疾病的相互作用進行概述,并討論其作為治療靶點的潛力。

1 炎癥小體的結構

炎癥小體主要由傳感器蛋白、接頭蛋白和效應蛋白組成。其中,核苷酸結合結構域樣受體(NLR)或黑色素瘤2樣受體(ALR)作為受體蛋白,含有caspase激活和募集結構域的銜接子凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)作為銜接分子,caspases作為效應蛋白,三者共同組裝而成炎癥小體〔5〕。傳感器蛋白的N末端結構域包括1個caspase募集區域(CARD)結構域或1個熱蛋白結構域(PYD),ASC由1個PYD和1個CARD組成,caspase-1則包含一個CARD。含有PYD蛋白的傳感器蛋白〔如NLR蛋白(NLRP)3、NLRP6、黑色素瘤缺乏因子(AIM)2〕與ASC的PYD蛋白結合,使ASC通過與pro-caspase-1的CARD相互作用激活caspase-1;相比之下,含有CARD的傳感器蛋白(NLRP1b和NLRC4)可以通過直接結合pro-caspase-1的CARD而不結合ASC來激活caspase-1。然而,ASC的存在可以增強包含CARD的傳感器蛋白的組裝和caspase-1的激活〔6〕。

2 炎癥小體的種類及其活化途徑

到目前為止,根據核心PRRs來分類,已經確定了五種不同類型的炎癥體,它們是NLR蛋白(NLRP)1、NLRP3、NLRC4、Pyrin及AIM2〔7〕。其中,NLRP1、NLRP3、NLRC4和AIM2最常被報道。

2.1NLRP1炎癥小體 人NLRP1炎癥體是第一個被鑒定的caspase-1激活蛋白復合物〔8〕。NLRP1由傳統的NLRP三部分結構域組成,包括PYD結構域、核苷酸寡聚化結構域(NACTH)、亮氨酸重復序列(LRR)〔9〕。然而,人類的蛋白質結構非常獨特,在LRR之后包括1個FIIND結構域,后面是1個CARD結構域,便于與pro-caspase-1結合。這些額外的結構域使NLRP1成為NLR家族中有著1 473個氨基酸和165.9 kD分子量的最長最大的成員〔10〕。NLRP1炎性體可被多種刺激物激活,如炭疽致死毒素(LT)、弓形蟲、細菌胞壁酰二肽(MDP)和ATP〔11〕。

在小鼠基因組中存在3種NLRP1同源基因,命名為NLRP1a、b和c〔12〕。小鼠NLRP1b和大鼠NLRP1被炭疽桿菌分泌的炭疽致死毒素激活。毒素的保護性抗原成分將致命因子成分運輸到宿主細胞,在宿主細胞中,致命因子誘導小鼠NLRP1b和大鼠NLRP1的N端蛋白水解裂解,以催化NLRP1炎癥體的激活。小鼠NLRP1a也被N端蛋白水解裂解激活。同樣,人類NLRP1在PYD和NBD之間的特定N端連接區域內進行蛋白水解。觀察發現,任何能夠誘導N端蛋白特異性位點水解的蛋白酶都足以激活NLRP1炎癥小體,這表明在嚙齒動物和靈長類動物中,蛋白水解是NLRP1炎癥小體激活的一種保守機制〔13〕。

弓形蟲誘導NLRP1激活的分子機制尚不清楚。一種可能性是,弓形蟲分泌一種破壞NLRP1 N端的效應蛋白,如LF蛋白酶或S福氏桿菌IpaH7.8;另一種可能性是,弓形蟲活動以某種方式操縱宿主細胞,NLRP1在宿主細胞狀態下感知到這種擾動從而被激活〔14〕。2007年,Faustin等〔15〕在一個無細胞系統中證明,MDP(一種細菌肽聚糖片段)可誘導NLRP1寡聚化和caspase-1激活,在ATP/Mg2+存在下進一步升高〔16〕。多種病原體和刺激物可以激活NLRP1。至少在致死因子蛋白酶存在的情況下,直接水解是小鼠和大鼠NLRP1激活的機制,且其他亞型和人類NLRP1也通過蛋白水解裂解被激活。NLRP1是否能被其他病原體來源的蛋白酶或細胞蛋白酶激活是今后研究的一個重要問題〔17〕。

2.2NLRP3炎癥小體 迄今為止,NLRP3炎癥體仍是研究最多的炎癥體。NLRP3是一種115 kD的胞質蛋白,表達于單核細胞、中性粒細胞、樹突細胞、淋巴細胞、成骨細胞和上皮細胞中〔2〕。NLRP3由3個結構域組成:N端PYD、中心NACHT和C端LRR。NACHT結構域具有ATP酶活性,這對NLRP3下游的寡聚至關重要。危險信號被LRR結構域感知,從而導致NLRP3單體通過其NACHT結構域聚集〔18〕。

典型NLRP3炎癥小體激活需要兩個信號:啟動信號和激活信號。啟動信號由Toll樣受體(TLRs)識別的微生物配體或細胞因子介導。啟動信號激活核轉錄因子(NF)-κB 途徑,導致pro-IL-1β和NLRP3蛋白水平的上調;激活信號由多種PAMP或DAMP刺激介導,并促進ASC和pro-caspase-1的組裝,從而激活NLRP3炎癥體復合物〔19〕。人們普遍認為NLRP3不能直接識別DAMPs或PAMPs并與配體結合。相反,多種配體誘導一系列的細胞事件,最終激活NLRP3,包括通過嘌呤能2X7受體(P2X7R)的鉀外流,溶酶體破壞導致組織蛋白酶B的泄漏,活性氧(ROS),線粒體DNA或線粒體心磷脂的釋放,鈣內流及細胞體積變化。其中NLRP3激活中鉀外流已被廣泛接受〔20〕。P2X7R位于NLRP3激活的上游。細胞外ATP參與P2X7R的形成,從而觸發K+的外流。K+外排導致細胞內環境中K+濃度低,導致線粒體功能障礙、細胞凋亡,隨后釋放ROS和氧化的mtDNA,激活NLRP3炎癥小體〔21〕。

NLRP3炎性小體的激活還有另一種途徑,即非典型NLRP3炎性小體激活。在革蘭陰性菌感染過程中,小鼠caspase-11或人caspase-4/5可感知胞質細菌細胞壁成分脂多糖(LPS),隨后裂解焦孔素(GSDM)D,從而驅動細胞焦亡和NLRP3炎性小體啟動〔22〕。

2.3NLRC4炎癥小體 NLRC4(也稱為IPAF,CARD12,或CLAN)在2001年被報道,在293T細胞中被證明與pro-caspase-1相互作用并誘導caspase-1蛋白水解和caspase-1依賴性細胞死亡〔23〕。與所有NLR家族成員一樣,NLRC4具有共同的3個結構域:N端CARD、NACHT和C端LRR〔24〕。NLRC4對胞質鞭毛蛋白或Ⅲ型分泌系統(T3SS)有反應,受到刺激后可激活caspase-1引起細胞焦亡〔25〕。

NLRC4不直接與其配體相互作用。相反,NLRC4通過與傳感蛋白NLR家族的凋亡抑制蛋白(NAIP)接觸而被激活,而 NAIP 物理結合鞭毛蛋白或 T3SS〔26〕。與NLRC4一樣,NAIP也包含一個中心NACHT域和一個C端LRR域及3個N端BIR域〔27〕。小鼠NAIP5(也可能是密切相關的NAIP6)通過T3SS或其他獨立于T3SS的方式直接識別細菌單體鞭毛蛋白進入巨噬細胞細胞質。另一個小鼠NAIP家族成員NAIP2識別T3SS的桿狀成分,而人類唯一的NAIP蛋白(hNAIP)作為T3SS針亞基的炎癥小體受體,通過相應的細菌配體結合NAIP受體,誘導NAIP和NLRC4之間的物理相互作用,導致低聚NLRC4炎癥小體復合物的形成。該復合物通過NLRC4和caspase-1之間的CARD-CARD相互作用,作為誘導下游caspase-1激活的平臺。caspase-1激活引發巨噬細胞炎癥反應,包括IL-1β/IL-18的加工和成熟及巨噬細胞的焦亡〔28〕。

2.4AIM2炎癥小體 AIM2是一種細胞質傳感器,可識別微生物或宿主來源的雙鏈DNA(dsDNA),是由一個N端PYD結構域和一個C端200-氨基酸的造血干擾素誘導的核蛋白(HIN200)結構域通過一個長連接器連接組成,而一些ALR如IFI16在C末端含有兩個HIN結構域〔29〕。AIM2通過PYD-PYD同型相互作用,再與ASC相互作用,而HIN結構域以序列獨立的方式與dsDNA結合。在缺乏配體的情況下,AIM2中PYD和HIN結構域之間的分子內相互作用使傳感器保持在自抑制狀態,從而防止PYD介導的寡聚并抑制HIN:DNA結合;只有在AIM2被dsDNA激活后,才能確保下游信號傳遞到適配器ASC〔30〕。

目前已知的AIM2炎癥小體的激活途徑有兩種:經典途徑和非經典途徑。在DNA病毒感染或轉染合成DNA類似物poly(dA:dT)的情況下,暴露在細胞質中的dsDNA直接被AIM2識別,從而引發炎癥小體組裝。這個過程被定義為典型激活,它是快速的,不需要Ⅰ型干擾素(IFN)的活動。許多DNA病毒都以這種方式激活AIM2炎癥小體,但并不是所有的DNA病毒都能被AIM2識別,如單純皰疹病毒(HSV)-1,這可能是因為在病毒感染過程中,DNA-AIM2相互作用被抑制〔31〕。

需要Ⅰ型IFN的非典型激活發生在大多數細菌感染中。土拉弗朗西斯菌和單核增生李斯特菌是最先發現的激活AIM2炎癥小體的活菌。肺炎鏈球菌、結核分枝桿菌、嗜肺軍團菌和金黃色葡萄球菌也被發現可以激活AIM2炎癥小體通路〔32〕。可能的機制是,細胞內的細菌逃脫液泡,暴露少量DNA,導致環狀GMP-AMP合成酶(cGAS)和IF204的激活,共同驅動Ⅰ型IFN的產生。Ⅰ型IFN一旦被激活,就會分泌到細胞外,以自分泌方式與Ⅰ型IFN受體(IFNR)結合,并通過Ⅰ型IFN/IRF1軸驅動下游鳥苷酸結合蛋白(GBPs)和免疫相關GTPase家族成員b (IRGB)10的表達。干擾素誘導蛋白GBPs和IRGB10可引起菌裂解,使細菌DNA泄漏到細胞質中,并最終被AIM2識別〔33〕。

無論是AIM2炎性體的經典激活還是非經典激活,都會導致GSDMD介導的細胞焦亡。AIM2炎性體的激活受細胞嚴格調控,需要ASC的磷酸化和線性泛素化。而自噬可以介導AIM2炎癥體的降解,從而終止炎癥反應〔34〕。

3 炎癥小體與代謝性疾病

越來越多的研究認識到炎癥相關成分對代謝性疾病的進展具有顯著的促進作用,作為PAMPs和DAMPs的胞質PPR,NLRs家族已被公認為代謝功能和疾病進展領域的核心角色。在過去的幾年里,有許多發現表明NLRP3和新陳代謝之間有密切的相互作用。NLRP3可能在正常生理狀態下是內穩態的,維持代謝平衡。然而,在慢性激活(例如在肥胖或高膽固醇血癥)時,NLRP3會變成病理性的并促進疾病的發生〔35〕。

3.1炎癥小體與DM DM在全球死亡原因中排名第七,是威脅全球公眾健康的重要因素。越來越多的關于DM并發癥發病機制的研究集中于炎癥體協調炎癥反應上。先天免疫系統的這些成分是信號平臺,一旦炎癥體組裝,將導致caspase-1激活,并將pro-IL-1β和pro-IL-18加工成其成熟的生物活性形式,引起細胞焦亡,促進糖尿病的發生發展〔36〕。

2型DM(T2DM)是一種以代謝失衡為特征的臨床疾病,占所有DM病例的90%以上〔37〕。據報道,胰島素抵抗和胰腺β細胞功能障礙是T2DM的特征〔38〕。Zhou等〔39〕研究表明,高糖誘導NLRP3炎性小體激活和IL-1β分泌,導致胰腺β細胞死亡。正常情況下,硫氧還蛋白(TRX)相互作用蛋白(TXNIP)與TRX結合,但在高糖環境下,TXNIP與TRX分離,與不同類型細胞的NLRP3炎性小體相互作用并激活。相比之下,已知γ-生育三烯醇在各種細胞類型中發揮強大的抗炎功能,可抑制NLRP3炎癥小體的激活和巨噬細胞向脂肪組織的招募,從而改善胰島素抵抗。事實上,γ-生育三烯醇不僅抑制了TNF受體相關因子6/NF-κB通路,而且激活了AMP激活的蛋白激酶/自噬軸,導致caspase-1切割減少。這些結果表明NLRP3炎性小體和相關的焦亡可能是糖尿病治療的新靶點〔40〕。

Al-Kafaji等〔41〕研究發現,T2D患者的單核細胞中AIM2的表達增加,且T2D患者血清中細胞游離線粒體DNA(mtDNA)水平較健康對照組升高,與病理呈正相關。外周血和白細胞mtDNA含量增加分別與T2DM腎病和高血糖有關。由感染或潛在的膳食脂質超載引起的線粒體應激過程中釋放的mtDNA已被證明會組裝AIM2炎性小體。這些結果提示AIM2的表達和激活以及循環中mtDNA水平的升高可能參與了T2DM患者的炎癥過程〔42〕。

藥理抑制劑CY-09和曲尼司特直接結合到NLRP3的NACHT結構域,分別抑制ATP酶活性和阻止NLRP3寡聚。兩種抑制劑的治療降低了高脂飲食誘導的DM小鼠的血糖,并顯示出更好的胰島素敏感性。植物化學抑制劑冬凌草甲素是一種香菇烷二萜類化合物,通過結合NACHT結構域中NLRP3的半胱氨酸279來阻斷NLRP3和NIMA相關蛋白激酶(NEK)7之間的相互作用,對T2D小鼠顯示出一定的作用。事實上,已經開發了數種NLRP3抑制劑,它們在T2DM中的療效需要進一步探索〔43〕。

3.2炎癥小體與AS AS是一種慢性炎癥性疾病,是心血管疾病的根本原因,通常被認為是由炎癥過程和脂質代謝異常的結果引起的〔44〕。AS由四種主要的致病事件組成:(a)內皮損傷;(b)脂蛋白(主要是氧化低密度脂蛋白和膽固醇晶體)在血管壁的積累;(c)單核細胞黏附、遷移、分化為巨噬細胞和泡沫細胞的形成;(d)平滑肌細胞的募集和增殖。一些研究證明NLRP3炎癥體會密切影響AS的進展〔45〕。AS斑塊中大量存在的膽固醇晶體和氧化低密度脂蛋白(oxLDL)可激活炎癥體,炎癥小體通過激活caspase-1和隨后的炎癥細胞因子成熟(如IL-1β和IL-18)誘導炎癥,引發細胞焦亡。且NLRP3炎癥小體介導的IL-1β和IL-18的產生可通過上調某些成分而加劇炎癥和AS斑塊形成〔46〕。根據Grebe等〔47〕研究,在AS小鼠模型中,oxLDL已被證明能啟動和激活巨噬細胞中NLRP3炎性小體:首先,oxLDL通過與巨噬細胞表面的CD36-TLR4-TLR6信號復合物結合,啟動NLRP3炎癥小體;然后,在被運輸到溶酶體后,oxLDL通過誘導膽固醇結晶和伴隨巨噬細胞溶酶體損傷激活NLRP3炎癥小體〔48〕。此外,Duewell等〔49〕也證明了NLRP3炎癥體在AS的發展和進展中的重要性。首先,他們發現早期AS病變中的膽固醇晶體(CCs)與炎癥細胞的存在成正比。其次,當小鼠腹腔注射CCs時,它會引起嚴重的炎癥反應。這種反應在NLRP3炎癥體成分缺乏的小鼠中是較弱的。而且,CCs已被證明能強烈激活小鼠和人巨噬細胞中的NLRP3炎性體〔50〕。

AIM2加速AS斑塊進展的確切機制尚不清楚,但AIM2誘導或調節幾種對AS至關重要的細胞反應正變得越來越清晰。首先,Pan等〔51〕研究表明AIM2可以提高載脂蛋白(Apo)E基因敲除小鼠細胞間黏附分子(ICAM)-1的水平。ICAM-1通過結合淋巴細胞功能相關抗原(LFA)-1參與AS易發區內皮單核細胞黏附和單核細胞募集,這是AS發生的關鍵事件;AIM2能夠觸發血管平滑肌細胞遷移和焦亡;AIM2通過促進促炎細胞因子的釋放來促進AS病變中的炎癥反應〔52〕。

MCC950是一種NLRP3炎性體抑制劑,它可以抑制巨噬細胞的炎癥反應。此外,MCC950通過抑制ox-LDL攝取和促進膽固醇流出,阻止巨噬細胞轉化為泡沫細胞;因此,可以防止AS的進展〔53〕。

3.3炎癥小體與肥胖 肥胖已成為世界范圍內一個嚴重的公共衛生問題。目前,全世界有6億多成年人(>18歲)患有肥胖癥〔54〕。它是DM、心血管疾病、高血壓、血脂異常、骨關節炎等肌肉骨骼疾病和其他疾病的主要風險因素。眾所周知,肥胖會導致脂肪因子和細胞因子釋放,促進機體的低度慢性炎癥。這種功能失調狀態導致全身性脂肪毒性,影響肝臟、肌肉和胰腺,激活NLRP3炎癥小體〔55〕。

肥胖以脂肪細胞肥大和增生為特征,伴有慢性局部炎癥。脂肪的過度積累導致腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-6、脂肪因子和單核細胞趨化蛋白(MCP)-1等促炎細胞因子的表達和釋放增強,它們進一步招募免疫細胞〔56〕。因此,單核細胞被招募到脂肪組織中,驅動向巨噬細胞的分化,誘導IL-1β等其他細胞因子的分泌,加劇炎癥狀態〔57〕。此外,肥胖脂肪組織中促炎性M1巨噬細胞與抗炎性/促分解性M2巨噬細胞的比例明顯升高,這有助于形成促炎性環境〔58〕。De Boer等〔59〕的研究表明,在體外共培養模型中,從魚油中提取的多不飽和脂肪酸(PUFA)可降低從高脂肪喂養小鼠分離的巨噬細胞中的炎癥體激活,以模擬肥胖脂肪組織中巨噬細胞和脂肪細胞之間的相互作用。值得注意的是,PUFA部分通過上調脂聯素降低NLRP3炎性體的表達、細胞因子分泌和M1巨噬細胞標記物,這表明脂聯素的減少與炎性體介導的脂肪組織炎癥有關。相比之下,患有或不患有T2DM的肥胖患者脂肪組織中炎癥體成分的表達增加,同時瘦素水平升高。總之,脂肪因子驅動的炎癥小體激活可能是促進肥胖相關慢性炎癥、胰島素抵抗和代謝紊亂的核心因素〔60〕。NLRP1也與肥胖相關,Netea等〔61〕的研究表明,與IL-18缺陷小鼠相似,NLRP1缺陷小鼠對飲食誘導的代謝紊亂具有抵抗力,并減少了肥胖〔62〕。

改善腸道菌群逐漸代表了治療或預防肥胖的新途徑。這些策略包括飲食控制,如使用益生菌、益生元或共生菌及糞便微生物群落的移植。相關實驗研究和人體臨床試驗表明,各種益生元和益生菌菌株的作用及其在改善肥胖相關代謝性疾病方面的潛在療效,它們可能通過逆轉生態失調和恢復腸道功能的完整性而產生有益的效果〔63〕。

綜上,炎性小體作為代謝應激的傳感器,當多種危險因素作用于機體時被激活,誘導細胞因子的成熟和釋放,引發炎癥級聯瀑布反應,從而促進DM、AS、肥胖等疾病的發生發展。因此,研發相關藥物并阻斷炎性小體激活可能成為防治此類疾病的一個新靶標,但其作用機制尚待深究,且除NLRP3炎癥小體以外的其他炎癥小體失調與疾病的關系也值得進一步研究。目前炎癥小體在代謝病領域中的研究仍有很大的空間,可能為今后探索疾病的發病機制提供有利的證據,為治療相關疾病的治療開辟新的途徑。