非小細胞肺癌不同中醫證型與腸道菌群-免疫功能相關性研究

周夏成，劉遠財，孫夢瑩，楊佳穎，陳卓，張愛琴

1.浙江中醫藥大學第二臨床醫學院，浙江杭州 310005；2.浙江省腫瘤醫院中醫科 中國科學院杭州醫學研究所，浙江杭州 310022

肺癌是目前世界范圍內發病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1]。腸道微生態是影響人體健康的重要因素，研究表明腸道菌群可通過調節炎癥、免疫反應等影響腫瘤的發生、發展[2-5]。中醫證候是疾病發展過程中某個階段生理、病理變化的高度概括，具有動態性和即時性的特征[6]。目前，“如何為中醫證候提供客觀的評判依據？如何用內在的變化表征外在的表現？”等問題已成為中醫藥領域的研究熱點。運用生物學方法研究中醫證候，有助于從客觀上揭示證候的本質[7]。因此，本研究運用16SrDNA 和酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）對不同中醫證型非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）進行腸道微生態學和免疫功能的研究，從生物學角度分析NSCLC 中醫證候的診斷依據，為今后中醫藥治療NSCLC 提供理論支持，為中醫藥抗腫瘤治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 診斷標準

患者相關病理報告示：組織病理學和（或）細胞學證實為NSCLC[8]。患者本人證候主訴符合《中醫臨床診療術語·證候部分》中醫證診斷標準[9]：①氣陰兩虛證：咳嗽痰少，氣短息弱，聲低懶言，面色觥白，自汗或盜汗，口干少飲，諸癥勞累后加劇，舌質淡嫩或偏紅，脈細弱；②陰虛內熱證：咳嗽少痰或無痰，或痰中帶血絲，口干、口渴，潮熱盜汗，夜寐不安，大便燥結，舌紅少苔或無苔，脈細數；③脾虛濕滯證：咳嗽痰多，痰白或黃白相兼，不欲食或納少腹脹便溏，面色萎黃，舌淡苔白膩有齒痕，脈滑；④氣滯血瘀證：咳嗽不暢，痛處固定，拒按，夜間加劇，面色黯淡，舌質紫邊尖有瘀點，脈澀或結代。

1.2 納入、排除及脫落標準

納入標準：①符合1.1 中的診斷標準；②無其他惡性腫瘤個人史；③符合中醫辨證標準；④年齡18～70 歲；⑤患者本人同意并簽署知情同意書。排除標準：①患者近14d 內使用過抗生素治療；②有精神疾病，無完全民事行為能力。脫落標準：①患者依從性差；②患者要求終止試驗。

1.3 樣本量估算

本研究采用Logistic 分析，擬探查變量有6 項，相關資料顯示Logistic 回歸樣本量要求每個自變量需有10～15 個樣本，經計算得出需收集60～90 例患者樣本。

1.4 一般資料

選取2019 年3 月—10 月于浙江省腫瘤醫院胸外科門診就診且診斷為NSCLC，并擬行肺癌根治術的患者作為患者組。患者入組前經中醫科兩名副主任以上中醫師同時辨證為氣滯血瘀證、脾虛濕滯證、氣陰兩虛證或陰虛內熱證。本研究共收集樣本70 例，其中排除或退出24 例，共納入46 例，其中氣滯血瘀證組13 例，脾虛濕滯證組12 例，氣陰兩虛證組7例，陰虛內熱證組14 例。選取同期12 名健康志愿者為對照組。本研究經浙江省腫瘤醫院倫理委員會審批通過（倫理審批號：IRB-2018-219）。

1.5 質量控制

1.5.1 組織培訓 研究開始前綜合培訓相關研究員，明確納排標準，并嚴格執行，要求各研究員熟練掌握樣本采集操作及儲存方式。

1.5.2 入組評估 患者入組前需經2 名副主任以上中醫師同時辯證確認分型，若有分歧則再請一名主任中醫師重新評估，方可入組。

1.5.3 標本采集 采集糞便標本過程中盡量采取無菌操作，過程迅速，盡量減少標本與空氣的接觸時間，并及時將標本放至–80℃冰箱內凍存備用。

1.6 觀察指標及方法

1.6.1 腸道微生態分析 DNA 提取：使用DNA 提取試劑盒對糞便總DNA 進行提取，將樣本進行16S V3-V4 區域擴增。聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）分析：以稀釋后的基因組DNA 為模板進行PCR。將1.5μl PCR 產物置于120V 電壓下持續電泳20min，再使用凝膠成像系統進行紫外線成像拍照。質檢測序：質檢合格后進行濃度定量，并進行相應的比例混合，最后運行Miseq 測序程序。引物信息見表1。

表1 樣本擴增引物信息

1.6.2 白細胞介素（interleukin，IL）-12 和干擾素γ（interferon，IFN-γ）檢測 ①分組：準備酶標包被板，將其置于框架上，選擇一處加入50μl 標準品，標記為標準品孔；另選一處加入10μl 待測樣本及40μl 樣本稀釋液，標記為待測樣品孔；選取一處空白對照孔。分別向待測樣本孔、標準品孔加入100μl 辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的檢測抗體。②溫育：將酶標包被板置于37℃ CO2孵箱中溫育1h 后取出，倒掉多余液體，用無菌磷酸緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗板5 次，每個孔250μl。③顯色：每孔分別加入50μl 顯色劑A液及顯色劑B 液，混勻30s 后把板置于37℃濕潤的培養箱中避光顯色15min，再加入50μl 終止液終止反應。④測量：測量各孔的吸光值并記錄分析數據。

1.7 統計學方法

采用SPSS 26.0 統計學軟件對數據進行分析處理。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較采用單因素方差分析或獨立樣本t檢驗，計數資料以例數（百分率）[n（%）]表示，比較采用X2檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組患者一般資料的比較

符合納排標準的NSCLC 患者46 例，病理類型均為腺癌。氣滯血瘀證組13 例，其中男7 例，女6例；平均年齡（59.46±7.34）歲；Ⅰ期病例8 例（61.5%），Ⅱ期病例5 例（38.5%）。氣陰兩虛證組7 例，其中男3 例，女4 例；平均年齡（60.57±4.79）歲；Ⅰ期病例3 例（42.9%），Ⅱ期病例4（57.1%）。脾虛濕滯證組12 例，其中男6 例，女6 例；平均年齡（58.58±6.71）歲；Ⅰ期病例6 例（50.0%），Ⅱ期病例6 例（50.0%）。陰虛內熱證組14 例，其中男8 例，女6 例；平均年齡（56.50±3.74）歲；Ⅰ期病例6 例（42.9%），Ⅱ期病例8 例（57.1%）。各組患者在疾病分期、年齡、性別等方面比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性，見表2。

表2 各組患者一般資料的比較

2.2 微生態組間差異

2.2.1 操作分類單元（operational taxonomic units，OUT）聚類及稀釋曲線 稀釋曲線可用來反映測序的數據量是否足以反映樣品內部物種的多樣性。曲線上升趨勢隨讀數條數的增加而逐漸趨于平坦，反映本研究的數據量較為合理，見圖1。

圖1 樣品物種豐富度稀釋曲線圖和箱線圖

2.2.2 韋恩圖 本研究對58 個樣品進行16S 測序分析，共產生 284 個分類操作單元（operational taxonomic unit，OTU）。其中，5 組樣本有117 個共有OTU，相比于健康對照組，氣滯血瘀證組有13 個特有的OUT，氣陰兩虛證組有3 個特有的OTU，脾虛濕滯證組有15 個特有的OTU，陰虛內熱證組有7個特有的OTU，健康對照組有18 個特有的OUT，見圖2。

圖2 OTU 韋恩圖

2.2.3 腸型分析 不同中醫證型的肺癌患者腸道菌群結構存在差異。其中，氣陰兩虛證組與陰虛內熱證組的樣本點較集中，菌群組成分布較為相似；脾虛濕滯證組與氣滯血瘀證組的樣本點較分散，群菌組成分布差異相對較大，見圖3。

圖3 腸型分布圖

2.2.4 差異物種分析 不同中醫證型中屬水平差異性菌屬相對豐度排行前20 的種系中，氣陰兩虛證組有6 個差異性菌屬，其中羅斯菌屬（Roseburia）、芽殖菌屬（Gemmiger）、毛螺菌屬（Lachnospiracea）、另枝菌屬（Alistipes）較健康組顯著富集；放線菌屬（Actinomyces）、腸桿菌屬（Enterobacteriaceae）、克雷伯菌屬（Klebsiella）較健康組顯著降低。陰虛內熱證組有4 個差異性菌屬，其中，羅斯菌屬、毛螺菌屬、瘤胃菌屬（Ruminococcaceae）較健康組顯著富集；埃希菌屬/志賀桿菌屬（Escherichia/Shigella）較健康組顯著降低。氣滯血瘀證組有5 個差異性菌屬，其中，毛螺菌屬、普氏菌屬（Prevotella）、梭菌屬（ClostridiumXⅠVa）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）較健康組顯著富集；放線菌屬（Actinomyces）較健康組顯著降低。脾虛濕滯證組有3 個差異性菌屬，其中，副細菌（Parabacteroides）較健康組顯著富集；而鏈球菌屬（Streptococcus）、放線菌屬較健康組顯著降低。

2.3 各組納入者的血清IL-12、IFN-γ 含量比較

與健康對照組比較，氣陰兩虛證組患者血清中的IFN-γ 含量顯著升高（P<0.05）；氣滯血瘀證組患者血清中的IL-12 含量顯著降低（P<0.01），其余組間差異無統計學意義（P>0.05），見表3。

表3 各組納入者的血清IL-12、IFN-γ 含量比較（±s，pg/ml）

表3 各組納入者的血清IL-12、IFN-γ 含量比較（±s，pg/ml）

注：與健康對照組比較，*P<0.05；＃P<0.01

組別 IL-12 P IFN-γ P健康對照組（n=12） 57.81±5.66 — 715.88±119.29 —氣陰兩虛證組（n=7） 71.47±21.29 0.101 1016.81±362.43* 0.043脾虛濕滯證組（n=12） 49.53±14.22 0.148 784.83±87.06 0.208氣滯血瘀證組（n=13） 40.20±11.72＃ 0.002 839.40±245.72 0.222陰虛內熱證組（n=14） 44.78±21.82 0.125 931.54±429.28 0.193

3 討論

基于本研究結果，筆者推測肺癌中醫證候變化的實質可能與腸道中某些菌群的數量變化或種類有關。故假設通過觀察不同中醫證型NSCLC 患者腸道菌群的多樣性及差異性，來探究NSCLC 患者不同中醫證型的生物學基礎，從而闡釋中醫證候的科學機理。

免疫失調是致使肺癌發生、發展的重要原因[10]。IFN-γ 是一種具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調節作用的細胞因子，是機體發揮免疫作用不可缺少的成分[11]。IL-12 被認為是調節免疫系統反應最有意義的細胞因子之一[12]。本研究結果提示，氣滯血瘀組血清中IL-12 含量較健康組顯著降低，氣陰兩虛組血清中的IFN-γ 含量較健康組顯著升高，其余無顯著性差異。在4 個證型中，血清IFN-γ 的濃度均高于健康組。筆者推測早期肺癌患者正氣尚足，處于邪正交爭階段，從而促進宿主分泌IFN-γ 調節免疫功能及增強抗腫瘤作用。

特定的腸道微生物與宿主免疫系統相互調節，共同影響人體健康[13-17]。有學者發現菌群可通過激活Myd88 通路來刺激免疫細胞分泌IL-1β 及IL-23，進一步誘導肺部產生IL-17 的γδT 細胞（主要是Vγ6+Vδ1+ T 細胞）增殖與活化，從而促進肺部腫瘤發展[18]。本研究中，羅斯菌屬、另枝菌屬的豐度在氣陰兩虛組中均較健康組顯著富集。相關研究證實，羅斯菌屬作為腸道中的有益菌，可促進免疫系統的抗腫瘤作用。Kenya Honda 研究團隊發現另枝菌屬等11 株腸道微生物可增加INFγ+CD8+T 細胞水平，提高由這些菌群介導的抗腫瘤免疫反應[19]。筆者推測，氣陰兩虛組血清中的IFN-γ、IL-12 濃度均較其他3 個證型組高可能與腸道羅斯菌屬、另枝菌屬有關。此外，本研究還檢測出諸多目前尚未證實影響腫瘤發展及免疫應答的菌屬，有待于進一步研究。

證候的生物學基礎是中醫藥現代化研究的關鍵部分，生物學方法的運用有助于闡明中醫藥的科學本質。筆者認為菌群的數量、結構、種類及人體與菌群之間都維持著相對的動態平衡，一旦平衡被破壞，就會導致菌群的失調進而影響疾病的發生、發展。這種微生態理論與中醫學中的陰陽學說、整體觀等基礎理論不謀而合。本研究對不同中醫證型NSCLC 患者進行腸道微生態學和免疫功能的分析，有助于為肺癌的中醫證候研究提供新思路。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。