基于鐵蛋白等血清學(xué)指標(biāo)的早期NAFLD 診斷模型的建立與驗(yàn)證

吳韻怡，敬強(qiáng)安，杜璟，童向民

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，浙江杭州 310053；2.浙江省人民醫(yī)院（杭州醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院）臨床醫(yī)學(xué)研究所，浙江杭州 310014

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除過量飲酒或其他明確的肝臟損害因素之外導(dǎo)致的經(jīng)影像學(xué)或肝組織病理學(xué)證實(shí)的肝細(xì)胞脂肪變>5%的臨床病理綜合征[1]。 NAFLD 包括較早期的單純性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver，NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）及NASH相關(guān)肝纖維化和肝硬化，最終進(jìn)展到肝細(xì)胞肝癌[2]。近年來，隨著肥胖和糖尿病等代謝相關(guān)疾病的流行，NAFLD 不僅成為全球性的公共衛(wèi)生問題之一，更在我國(guó)的慢性肝病病因中位居第一。調(diào)查分析顯示NAFLD 在我國(guó)的流行率高達(dá)29.2%，且數(shù)據(jù)還在逐年上升[3]。目前，NAFLD 的早期診斷和相關(guān)治療仍有非常大的提升空間。肝臟活檢仍是診斷NAFLD 的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但由于其有創(chuàng)性，且采樣和評(píng)價(jià)都具有一定偶然性和主觀性，在臨床進(jìn)行大規(guī)模推廣十分不易，對(duì)于人力、物力都是較大的挑戰(zhàn)[4-5]。為方便臨床普及應(yīng)用，減少操作難度，近年來血清學(xué)診斷受到各界廣泛關(guān)注。本研究通過對(duì)浙江省人民醫(yī)院收治的NAFLD 患者的血清學(xué)指標(biāo)進(jìn)行分析，探討以鐵蛋白為主的血清學(xué)指標(biāo)與早期NAFLD 診斷的相關(guān)性，并使用二元Logistic 回歸分析后構(gòu)建相關(guān)的血清學(xué)診斷模型，試圖提供更為敏感、便捷的診斷方法。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2019 年6 月1 日至2022 年6 月30 日在浙江省人民醫(yī)院確診的NAFLD 患者和健康體檢者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床診斷為NAFLD 早期（肝區(qū)脂肪沉積；脂肪肝）；②年齡16～65 歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并酒精性肝炎、病毒性肝炎、藥物性肝炎、自身免疫性肝炎、肝硬化、肝細(xì)胞肝癌等其他相關(guān)肝臟疾病的患者；②有飲酒史的患者；③臨床數(shù)據(jù)不完整的患者。本研究經(jīng)浙江省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過（倫理審批號(hào)：浙人醫(yī)倫審2022 其他第（388）號(hào)）。

1.2 觀察指標(biāo)

收集患者的年齡、性別及血紅蛋白、白蛋白、球蛋白、鐵蛋白、總膽固醇、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）等血清學(xué)指標(biāo)，及影像學(xué)檢查結(jié)果。

1.3 相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)

于清晨分別采集兩組入選者的空腹靜脈血5ml，將其注入含有分離膠成分的試管中，靜置后以3500轉(zhuǎn)/min 離心10min（離心半徑為12.5cm），檢測(cè)采用上層血清。血常規(guī)采用希森美康XE-2100 全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀（日本希森美康公司）進(jìn)行分析。生化指標(biāo)通過BECKMAN-COULTER 5800 型全自動(dòng)生化分析儀用連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定（試劑為Beckman-Coulter實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品）。測(cè)定時(shí)分別用各自公司提供的高、低值質(zhì)控樣本進(jìn)行質(zhì)量保證。

1.4 診斷模型的構(gòu)建和驗(yàn)證

將患者按照80∶20 進(jìn)行隨機(jī)分組，分為訓(xùn)練集（n=184，其中89 例NAFLD 患者，95 名健康者）和驗(yàn)證集（n=48，其中23 例NAFLD 患者，25 名健康者）。通過訓(xùn)練集相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行模型構(gòu)建，首先將患者相關(guān)血清學(xué)指標(biāo)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，本研究將存在明顯差異的指標(biāo)納入向前選擇[似然比（likelihood ratio，LR）]，以此構(gòu)建回歸模型，并據(jù)此繪制受試者操作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC 曲線）。對(duì)驗(yàn)證集中的數(shù)據(jù)進(jìn)行校驗(yàn)。隨后進(jìn)行敏感度和特異性的相關(guān)分析，繪制ROC 曲線，并計(jì)算曲線下面積（area under the curve，AUC）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 27.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（Q1，Q3）]表示，比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（百分率）[n（%）]表示，比較采用X2檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 入選者的一般資料分析

112 例NAFLD 患者年齡18～65 歲，其中男100例，女12 例。健康體檢者120 名，年齡16～65 歲，其中男56 名，女64 名。將232 名入選者隨機(jī)分為訓(xùn)練集和驗(yàn)證集，見表1。

表1 訓(xùn)練集和驗(yàn)證集入選者的一般人口學(xué)資料比較

2.2 訓(xùn)練集中入選者的臨床資料比較

訓(xùn)練集中NAFLD 組患者與健康組體檢者的球蛋白、總膽固醇、血紅蛋白、尿酸等血清學(xué)指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。NAFLD 組患者年齡較大，且男性較多，總蛋白、白蛋白較健康組體檢者低（P<0.001）；鐵蛋白、ALT、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（γ-glutamyl transferase，GGT）較健康組體檢者高（P<0.001），見表2。

表2 訓(xùn)練集中入選者的臨床資料比較（±s）

表2 訓(xùn)練集中入選者的臨床資料比較（±s）

指標(biāo) 健康組（n=95）NAFLD 組（n=89） t P血紅蛋白（g/L） 143.62±15.55 145.39±19.48 0.536 0.593總蛋白（g/L） 71.78±3.74 67.78±6.10 5.464 <0.001白蛋白（g/L） 45.14±2.15 40.86±4.50 8.225 <0.001球蛋白（g/L） 26.64±3.12 26.92±3.20 0.538 0.591鐵蛋白（μg/L） 143.62±15.54 383.13±389.59 5.721 <0.001總膽固醇（mmol/L） 4.71±1.79 4.96±1.33 1.245 0.215尿酸（μmol/L） 368.03±91.19 395.16±110.58 1.652 0.100 ALT（U/L） 17.26±10.25 51.77±45.59 6.980 <0.001 GGT（U/L） 17.06±8.51 73.27±85.79 6.113 <0.001

2.3 建立診斷預(yù)測(cè)模型

在訓(xùn)練集中將血紅蛋白、總蛋白、球蛋白、白蛋白、總膽固醇、尿酸等9 個(gè)變量進(jìn)行單因素分析，并將P<0.05 的5 個(gè)變量納入多因素Logistic 回歸分析，最終以白蛋白、鐵蛋白、ALT、GGT 4 項(xiàng)指標(biāo)構(gòu)建NAFLD 診斷預(yù)測(cè)模型。回歸方程：Logit（P）=–11.448+0.391×白蛋白-0.008×鐵蛋白–0.057×ALT-0.097×GGT，見表3。

表3 多因素Logistic 回歸分析

2.4 診斷預(yù)測(cè)模型的評(píng)價(jià)

訓(xùn)練集中，該模型預(yù)測(cè)NAFLD 的AUC 為0.968（P<0.001），95%CI：0.943～0.992。AUC 較接近1，提示該預(yù)測(cè)模型區(qū)分度較好。根據(jù)約登指數(shù)確定最佳診斷界值為0.640，在此閾值下，該模型分類性能較好，敏感度為93.70%，特異性為80.00%，見圖1。

圖1 訓(xùn)練集診斷模型預(yù)測(cè)NAFLD 的ROC 曲線

2.5 診斷預(yù)測(cè)模型的驗(yàn)證

根據(jù)訓(xùn)練集中模型診斷得到的最佳閾值0.64，對(duì)應(yīng)總分界值為3.29。在驗(yàn)證集構(gòu)建的預(yù)測(cè)模型中，總分>3.29 分判為陰性預(yù)測(cè)結(jié)果，即健康者；總分≤3.29 分判為陽(yáng)性預(yù)測(cè)結(jié)果，即NAFLD 患者。采用該閾值預(yù)測(cè)時(shí)，模型預(yù)測(cè)NAFLD 的敏感度為91.30%，特異性為80.00%，說明該模型準(zhǔn)確度較好。在驗(yàn)證集中繪制相關(guān)ROC 曲線，得到AUC 為0.941（P<0.001），95%CI：0.880～1.000，說明該閾值下預(yù)測(cè)模型區(qū)分度較好，見圖2、表4。

圖2 驗(yàn)證集診斷模型預(yù)測(cè)NAFLD 的ROC 曲線

表4 驗(yàn)證集中模型診斷結(jié)果（n）

3 討論

NAFLD被認(rèn)為是世界范圍內(nèi)慢性肝病的主要病因，且隨著疾病進(jìn)展，有可能進(jìn)展為肝硬化甚至肝細(xì)胞癌，一旦發(fā)展至終末期，肝移植是唯一的治療手段。因此，早診斷、早干預(yù)對(duì)患者意義較大。

既往有許多學(xué)者嘗試用血清學(xué)指標(biāo)篩查NAFLD，近年來國(guó)內(nèi)也進(jìn)行了許多相關(guān)研究，并建立脂肪性肝病指數(shù)、肝臟脂肪指數(shù)、NAFLD 篩查評(píng)分等模型，部分模型評(píng)估所需指標(biāo)煩瑣，計(jì)算復(fù)雜且準(zhǔn)確度未被外部驗(yàn)證，所以大多數(shù)模型仍處于研究狀態(tài)，尚未被應(yīng)用于臨床[6]。目前，暫無可完全替代肝組織穿刺活檢的診斷方法。

鐵過載被認(rèn)為與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，已有研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)NAFLD 患者出現(xiàn)肝鐵過載[7]。鐵作為人體不可或缺的微量元素之一，幾乎存在于全身所有組織中。鐵蛋白作為人體中貯存鐵的主要形式，不僅是十分重要的血漿成分，而且其含量間接反映人體內(nèi)鐵的貯存情況[8-9]。肝臟是重要的儲(chǔ)鐵器官，也是鐵過載主要損傷的靶器官之一[10]。鐵是機(jī)體內(nèi)發(fā)生脂質(zhì)氧化反應(yīng)的關(guān)鍵物質(zhì)。過量的鐵可導(dǎo)致氧自由基的大量生成，促使肝臟發(fā)生進(jìn)一步脂質(zhì)過氧化損傷，并在同時(shí)刺激肝臟中膠原蛋白的合成，使肝臟病變加重。在脂肪肝的過程中，肝細(xì)胞積累三酰甘油，由于脂肪的變性和氣球樣變性，受損肝細(xì)胞中的鐵被釋放到血液中，導(dǎo)致鐵蛋白濃度上升，從而形成惡性循環(huán)。科學(xué)研究揭示鐵蛋白含量的增加在一定程度上可影響肝細(xì)胞的脂肪變性和炎癥浸潤(rùn)。本研究證實(shí)鐵蛋白對(duì)提高血清學(xué)診斷NAFLD 的準(zhǔn)確性有較好的作用。

本研究通過對(duì)232 名入選者進(jìn)行回顧性分析，最終將白蛋白、鐵蛋白、ALT、GGT 4 項(xiàng)指標(biāo)構(gòu)建NAFLD 診斷預(yù)測(cè)模型。該模型在訓(xùn)練集中的AUC為0.968，95%CI：0.943～0.992，AUC 接近1，提示該模型區(qū)分度較好。根據(jù)約登指數(shù)確定最佳診斷界值為0.640，在此閾值下，敏感度為93.70%，特異性為80.00%，提示該模型準(zhǔn)確度較好。在驗(yàn)證集中，模型預(yù)測(cè)NAFLD 的敏感度為91.30%，特異性為80.00%。在驗(yàn)證集中繪制ROC 曲線，求得AUC 為0.941，95%CI：0.880～1.000，說明預(yù)測(cè)模型具有較好的區(qū)分度。

綜上，本研究構(gòu)建的模型僅需部分易獲得、易檢測(cè)的血清學(xué)指標(biāo)，即可較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)NAFLD，與肝穿刺及影像學(xué)檢查比較，具有較好的重復(fù)性和較低的檢測(cè)費(fèi)用，可用于NAFLD 的早期篩查。本研究的不足為回顧性分析、樣本量較小且為單中心研究等，未來可采用前瞻性研究，并加大樣本量進(jìn)行多中心研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。