吉蘭-巴雷綜合征患者外周血記憶性T 細胞和記憶性B 細胞亞群的變化及其臨床意義

劉壇，黃小雨，張勇

1.湖州市第一人民醫院神經內科，浙江湖州 313000；2.徐州醫科大學附屬醫院神經內科，江蘇徐州 221000

吉蘭-巴雷綜合征（Guillain-Barré syndrome，GBS）是一類免疫介導的急性炎性周圍神經病，主要病理生理機制是外周神經中抗體-抗原相互作用引起的補體介導的神經損傷[1-2]。既往研究發現體液免疫及細胞免疫共同參與此病的發生，然而國內外關于GBS 免疫細胞亞群的研究尚不充分，尤其是記憶性細胞亞群在GBS 患者外周血中的占比仍需進一步探討。已有文獻報道記憶性B 細胞參與了GBS 的發病[3]；也有學者指出記憶性T 細胞可幫助記憶性B 細胞更快速地產生抗體反應[4]。由此推測記憶性T 細胞及記憶性B 細胞均可能參與GBS 的發病。本研究通過分析GBS 患者記憶性T細胞及記憶性B 細胞亞群的改變，為探索GBS 的發病機制提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性選取2018 年6 月至2020 年12 月于徐州醫科大學附屬醫院神經內科住院的16 例GBS 患者作為研究組，其中男8 例、女8 例，年齡28～78歲，平均（54.38±15.24）歲。選取同期16 名來院的健康體檢者作為對照組，其中男7 例、女9 例，年齡29～69 歲，平均（46.56±11.18）歲。納入標準：①符合《中國吉蘭-巴雷綜合征診治指南2019》診斷標準[1]；②年齡≥18 歲；③未接受靜脈注射免疫球蛋白治療。排除標準：①其他自身免疫性疾病，如白血病、類風濕疾病、甲狀腺疾病、人類免疫缺陷病毒感染的患者；②器官移植的患者；③診斷不明確或臨床資料不全、資料丟失的患者。所有研究對象均簽署知情同意書。本研究經徐州醫科大學附屬醫院倫理委員會審批通過（倫理審批號：XYFY2020-JS019-01）。

1.2 方法

所有研究對象均于入組后空腹抽取6ml 靜脈血，其中2ml 靜脈血用乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝，余靜脈血不抗凝直接分離血清。采用人淋巴細胞分離液（天津灝洋生物公司）分離得到外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），經磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌離心后加入鼠抗人CD3-APC-Cy7 抗體、鼠抗人CD4-APC 抗體、鼠抗人CD8-Percp-Cy5-5 抗體、鼠抗人CD45RAV450 抗體、鼠抗人CCR7-BV510 抗體（美國BD 公司）；同時設同型對照管，室溫避光孵育15min 后，流式細胞儀檢測記憶性T 細胞亞群，其中CD4+初始T 細胞（naive T cells，TN）表型為CD3+、CD4+、CD8-CD45RA+、CCR7+，CD4+中央記憶性T 細胞（central memory T cells，TCM）表型為CD3+、CD4+、CD8-CD45RA-、CCR7+，CD4+效應記憶性T 細胞（effector memory T cells，TEM）表型為CD3+、CD4+、CD8-CD45RA-、CCR7-，CD4+終末分化效應記憶性T細胞（terminally differentiated effector memory T cells，TEMRA）表型為CD3+、CD4+、CD8-CD45RA-、CCR7-；CD8+TN 細胞表型為CD3+、CD4-、CD8+CD45RA+、CCR7+，CD8+TCM 細胞表型為CD3+、CD4-、CD8+CD45RA-、CCR7+，CD8+TEM 細胞表型為CD3+、CD4-、CD8+CD45RA-、CCR7-，CD8+TEMRA細胞表型為CD3+、CD4-、CD8+CD45RA-、CCR7-。在分離的PBMC 中加入鼠抗人CD45-Percp-Cy5-5 抗體、鼠抗人CD19-APC、鼠抗人CD27- BV510、鼠抗人CD38-FITC 抗體（美國BD 公司），同時設同型對照管。室溫避光孵育15min 后，流式細胞儀檢測記憶B 細胞亞群，其中記憶B 細胞表型為CD19+CD27+，漿母細胞表型為CD19+CD27+CD38+。

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0 統計學軟件對數據進行處理分析。符合正態分布的計量資料用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。不符合正態分布的計量資料以中位數（四分位數間距）[M（Q1，Q3）]表示，組間比較采用秩檢驗。計數資料以例數（百分率）[n（%）]表示，組間比較采用X2檢驗。采用Pearson 相關性分析CD4+TEM及CD8+TEM 占比與Hughes 殘疾評分、腦脊液蛋白、腦脊液免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）及記憶性B 細胞的相關性。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GBS 患者的一般資料及外周血記憶性T 細胞亞群占比分析

GBS 患者的一般資料分析見表1。與對照組相比，研究組患者的CD4+TN 及CD8+TN 均明顯下降（P<0.05），CD4+TEM 及CD8+TEM 均明顯升高（P<0.05），TCM 及TEMRA 在CD4 和CD8 上的比例差異無統計學意義（P>0.05），見表2。

表1 GBS 患者的一般資料

表2 兩組患者的外周血記憶性T 細胞亞群占比比較（n=16）

2.2 兩組患者的外周血記憶性B 細胞占比比較

與對照組比較，研究組患者的記憶性B 細胞比例明顯升高（P<0.05），漿母細胞的比例差異無統計學意義，見表3。

表3 兩組患者的外周血記憶性B 細胞占比比較（n=16）

2.3 GBS 患者外周血CD4+TEM 和CD8+TEM 占比與GBS 患者臨床嚴重程度的相關性分析

GBS 患者外周血CD4+TEM 及CD8+TEM 占比與Hughes 殘疾評分、腦脊液蛋白、腦脊液IgG 及記憶性B 細胞占比均呈正相關（P<0.05），見圖1。

圖1 GBS 患者外周血TEM 占比與GBS 臨床嚴重程度相關性分析

3 討論

GBS 發病與自身免疫功能障礙相關，各種類型的活化的T 細胞被認為是GBS 的發生和發展的協調者。研究表明記憶性T 細胞對B 細胞生發中心的形成及產生對抗髓鞘的抗體具有十分重要的作用，其中 TEM 細胞可通過產生細胞因子白細胞介素（interleukin-17，IL-17）和重組人干擾素（recombinant human interferon-r，IFN-γ）等炎癥因子參與B 細胞的分化[5]；同時記憶性B 細胞也與GBS 的發病相關[3]。因此，進一步明確記憶性B 細胞亞群、記憶性T 細胞亞群尤其是TEM 細胞在GBS 患者外周血中的占比，對解釋GBS 的發病機制至關重要。

有學者根據是否表達CD45RA 區別初始T 細胞和記憶性T 細胞，并進一步依據趨化因子受體CCR7的表達將記憶性T 細胞分為TCM 和TEM[6]。與初始T 細胞和TCM 細胞相比，TEM 細胞更能快速被抗原識別，迅速激活免疫反應，且可立刻到達炎癥部位并發揮作用[7]。既往多項研究表明，TEM 細胞與一些自身免疫性疾病如多發性硬化、系統性紅斑狼瘡 、結腸炎、1 型糖尿病等的發生、發展、復發及嚴重程度密切相關[8-12]。本研究結果也顯示，與對照組相比，研究組患者外周血 CD4+TEM 細胞和CD8+TEM 細胞占比更高，差異有統計學意義。初始B 細胞成熟后，與抗原相遇被其激活，隨后分化為CD19+CD27+記憶性B 細胞；當記憶性B 細胞再次與相同抗原相遇時就會增殖，分化為漿細胞，產生特異性抗體，從而發揮介導體液免疫應答的作用。據報道，記憶性B 細胞在一些自身免疫性疾病如系統性紅斑狼瘡、類風濕關節炎、自身免疫性溶血性貧血等疾病中發揮至關重要的作用[13-15]。Wang 等[3]發現記憶B 細胞在GBS 急性期顯著增加，并隨著病情的恢復而減少，進一步的Spearman 相關分析顯示GBS 的臨床嚴重程度與患者外周血中記憶B 細胞的占比呈正相關。本研究結果與之一致，研究組患者記憶性B 細胞比例高于對照組；此外，進一步Pearson相關性分析顯示CD4+TEM 及CD8+TEM 細胞占比與Hughes 殘疾評分、腦脊液蛋白、腦脊液IgG 及記憶性B 細胞占比均呈正相關，CD4+TEM 及CD8+TEM細胞與疾病臨床嚴重程度呈正相關。在GBS 發病中發揮重要作用，并可能通過自身效應功能調節B 細胞的分化參與GBS 的發病。

綜上，本研究發現GBS 患者存在記憶性T 細胞和記憶性B 細胞亞群免疫紊亂，外周血中CD4+TEM細胞、CD8+TEM 細胞及記憶性B 細胞占比升高可能是GBS 發病過程中的一個外周免疫機制。進一步深入探討TEM 細胞參與GBS 發病的機制有望成為治療GBS 的新靶點。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。