年齡相關肝病中的肝臟細胞異質性研究進展

李清鈺，廖春雨，趙思羽，原玉柱，趙永睿，肖莉，孫麗新

1.中國藥科大學江蘇省藥效研究與評價服務中心，江蘇南京 211198；2.湖州師范學院生命科學學院浙江省媒介生物學與病原控制重點實驗室，浙江湖州 313000

隨著機體的衰老，肝臟的生物結構與功能不斷退化，年齡相關肝病發病率增加。研究發現年齡相關肝病患者體內的多種肝臟細胞（肝細胞、肝竇內皮細胞、肝星狀細胞及庫普弗細胞）衰老表現形式不同，具體表現為蛋白質和生物標志物表達水平及細胞功能等方面的差異，即肝臟細胞異質性，但其相關疾病的具體機制與聯系尚不清楚。本文就肝臟細胞衰老在相關疾病發生與發展中的作用進行綜述，以期為延緩肝臟衰老及相關疾病治療提供新靶點和新思路。

1 年齡相關肝臟疾病

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）已成為我國最常見的慢性肝病，年齡是NAFLD 進展中密切相關的因素之一[1]。NAFLD包括單純性脂肪變性和非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）及相關的肝纖維化和肝硬化[2]。一項研究對患有NAFLD/NASH的人群進行肝臟活檢和廣泛的特征分析，結果表明NAFLD/NASH 患者體內多種衰老肝臟細胞增加[3]。同樣的多項研究表明，在肝纖維化[4]、肝硬化[5]和肝細胞肝癌（hepatic cell carcinoma，HCC）[6]中，年齡均是高風險因素。此外，年齡也是酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）[7]、病毒性肝炎[8]等慢性肝病的影響因素之一。由此推測，肝臟細胞衰老可能在慢性肝病的發生與發展中發揮重要作用。

2 相關疾病中的肝臟細胞異質性

2.1 肝細胞

肝細胞是肝臟基本功能單位肝小葉中主要的實質細胞，也是肝臟功能的主要承擔者。衰老肝細胞發生形態、功能及表觀遺傳修飾等方面的變化。衰老肝臟中肝細胞數量減少，體積增加[9]。隨著年齡增長，NRF2 信號減退相關的氧化還原失衡會拮抗Wnt/β-catenin 信號通路，激活FoxO、p53 相關信號通路，從而削弱肝細胞增殖[10]。NASH 患者體內可見球形肝細胞，說明肝細胞發生變性，即微管破裂和嚴重損傷，表明肝細胞損傷可能推動NASH 進展[11]。

衰老肝細胞的衰老相關標志物表達增加，發生G1/S 期細胞周期阻滯。衰老肝細胞中細胞周期抑制因子p16Ink4a、p21 及p53 表達增加，衰老相關的β-半乳糖苷酶和異染色質蛋白1β 表達增加，氧化應激來源的脂質過氧化產物和脂滴積累，活性氧（reactive oxygen species，ROS）增加[9]。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）可上調肝細胞中p16 和p21 水平，促進Rb 蛋白活化[12]。NAFLD 小鼠的肝細胞中p16、p53、p21 及衰老相關的β-半乳糖苷酶的表達水平上調[13]。此外，NAFLD 患者的肝細胞中細胞周期蛋白依賴性激酶4（cyclin-dependent kinases 4，CDK4）水平升高，而CDK4 抗性C/EBPα-S193A 小鼠則不會隨著年齡的增長而發生肝脂肪變性，故抑制CDK4可能是慢性肝病治療新途徑[14]。因此，改善衰老肝細胞周期阻滯可能成為慢性肝病的潛在治療策略。

衰老肝細胞釋放白細胞介素（interleukin，IL）-1、IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）等衰老相關分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP）[15]。HBV 和丁型肝炎病毒（hepatitis D virus，HDV）陽性肝硬化及HCC 患者的肝細胞中TNF-α 和IL-6 水平升高，且HBV 陽性HCC 患者的肝細胞過表達MMP-9 和低表達TIMP-1 和TIMP-3，從而獲得更高的侵襲潛力[12]。由此推測，衰老肝細胞的SASP 加重慢性肝病，而抑制SASP 成分分泌可能有助于緩解病情。

衰老肝細胞自噬功能下降，蛋白質穩態喪失。氧化和錯誤折疊的蛋白質及其聚集體的積累可引發細胞蛋白質毒性，如脂褐素積累和ROS 產生增加，從而進一步抑制自噬，形成惡性循環[16]。NAFLD 小鼠的肝細胞自噬水平下調，表現為LC3II/LC3I 比率降低、自噬底物p62 蛋白積累及線粒體自噬相關蛋白Fundc1 表達減少[13]。因此，維持肝細胞自噬水平可能有助于延緩NAFLD 進展。

2.2 肝竇內皮細胞

肝竇內皮細胞（hepatic sinusoidal endothelial cell，LSEC）是肝臟中主要的非實質細胞，也是肝竇內壁的組成單位。衰老LSEC 中細胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）和血管性血友病因子（von Willebrand Factor，vWF）等介導偽毛細血管化的標志物表達增加，小窩蛋白-1、參與調控肝細胞再生的無翅型MMTV 整合位點家族成員2（wingless-related MMTV integration site 2，Wnt2）及肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）表達減少[17]。衰老LSEC 發生偽毛細血管化，表現為窗孔變小、數量減少及內皮增厚，這些變化與竇周基底層形成和細胞外基質（extracellular matrix，ECM）在竇周隙中的沉積增加有關。偽毛細血管化導致LSEC 內吞減弱，大分子清除率降低，這可能與清道夫受體功能受損相關[17]。偽毛細血管化的LSEC可激活靜止的肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）使其轉化為肌成纖維細胞，導致肝纖維化發生[18]；說明衰老LSEC 偽毛細血管化是慢性肝病發展的關鍵步驟，維持LSEC 的正常表型和功能可抑制NASH向肝纖維化的發展。另外，在LSEC 中阻斷ICAM-1可抑制腫瘤細胞在體內外的粘附與遷移，提示下調衰老LSEC 中ICAM-1 表達，抑制LSEC 偽毛細血管化，有助于延緩HCC 進展[19]。

TNF-α、IL-1、IL-6 等SASP 成分在衰老LSEC中的表達相對增加[20]。與其他衰老肝臟細胞相比，p16INK4a主要在衰老LSEC 中表達[21]。年齡相關的氧化應激上調LSEC 中ROS 水平，且由于抗氧化酶血紅素加氧酶-1 的表達減少，衰老LSEC 更易受氧化應激的損害[22]。

自噬對于LSEC 穩態維持十分重要，而衰老相關的氧化應激可導致LSEC 自噬失調，然而自噬失調也會削弱其處理氧化應激的能力，從而加重肝纖維化，形成惡性循環[23]。NASH 患者體內的LSEC 自噬失調上調趨化因子、細胞因子及黏附分子的表達，進而促進肝臟炎癥、內皮-間質轉化及肝纖維化過程[24]。因此，維持LSEC 自噬水平可能有助于延緩肝纖維化進展。

2.3 HSC

HSC 是位于Disse 間隙內的周細胞。迄今為止，衰老對HSC 影響的相關研究較少，但HSC 激活與肝纖維化發病及進展的聯系一直是近年的研究熱點。正常情況下HSC 處于靜止狀態，在肝損傷或衰老肝細胞誘導下被激活，活化的HSC 釋放富含纖維蛋白的納米級囊泡，這是肝纖維化與肝硬化發展的關鍵啟動過程[13]。活化的HSC 高表達α-平滑肌肌動蛋白和結蛋白，并分泌過量的ECM 成分，如膠原蛋白和纖連蛋白，導致ECM 過度沉積，進而驅動肝纖維化進展[25]。衰老肝細胞中SIRT1 的年齡依賴性下降激活NLRP3 炎癥小體炎癥通路，進而驅動HSC 活化，導致老年ALD 小鼠的嚴重肝纖維化[26]。而衰老的HSC 分泌MMP，消化基質金屬蛋白和膠原蛋白，從而減少ECM 沉積，以限制與逆轉肝纖維化[25]。因此，誘導HSC 衰老可能是抑制肝纖維化發生與發展的有益機制。但是，衰老HSC 還表達SASP 相關成分，其似乎在NAFLD 進展為HCC 的過程中起關鍵作用[27]。

衰老HSC 自噬水平下調。而自噬可抑制活化HSC 釋放纖維化細胞外囊泡，進而減輕肝纖維化[25]，故上調HSC 自噬水平可能是肝纖維化治療策略。

2.4 庫普弗細胞

庫普弗細胞位于肝竇腔內，是肝臟常駐巨噬細胞中最具代表性的免疫細胞，參與感染和大分子吞噬的先天免疫反應。盡管庫普弗細胞激活常見于肝脂肪變性、NASH 及肝纖維化等大多數慢性肝病，但與HSC 類似，衰老對庫普弗細胞影響的研究并不多[28]。衰老對巨噬細胞的影響包括數量增加，在含有T、B 細胞的大淋巴結構中分布增加，吞噬、自噬作用減弱，并呈現促炎狀態[29-30]；細胞因子分泌增加，如IL-6，但TNF-α、Mrc1、Arg1 及IL-10 的表達在衰老庫普弗細胞中未發生變化[20]。

3 衰老肝臟細胞作為疾病治療靶點

3.1 靶向消除衰老肝臟細胞

嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）-T細胞通過靶向消除表面高表達尿激酶型纖溶酶原激活物受體的衰老肝臟細胞，可改善CCl4 誘導或NASH 模型小鼠的肝纖維化和肝功能，表明Senolytic CAR-T 細胞對不同病因的肝纖維化均具有治療作用[31]。BET 家族蛋白質降解劑通過減少非同源末端連接加劇DNA 雙鏈斷裂，并上調自噬基因表達，消除肥胖小鼠肝臟中衰老HSC，從而抑制HCC的發展[27]。但在WT 小鼠經達沙替尼+槲皮素給藥被清除衰老HSC 后，顯示出更多的纖維結締組織增生，表明衰老HSC 的清除將加重肝纖維化；與之相反，誘導活化HSC 衰老則有益于肝纖維化消退[25,32]。由此可知，活化HSC 在不同慢性肝病中所發揮的作用不同，對其進行深入探究將有助于對不同慢性肝病患者進行針對性治療。另外，衰老LSEC在體內仍然執行包括抗炎、內吞、分泌促肝細胞再生因子及維持HSC 表型等重要功能。通過基因工程手段靶向清除高表達p16INK4a的衰老LSEC 后，由于沒有新的LSEC 來填補空缺，反而誘發了肝臟纖維化的發生[33]。因此，并非所有衰老肝臟細胞的清除均有利，衰老肝臟細胞清除治療的靶向性顯得尤為重要。

3.2 延緩肝臟細胞衰老

可溶性環氧化物水解酶/環氧合酶-2 雙重抑制劑PTUPB 可通過SIRT1 抑制PI3K/AKT/mTOR 通路增強肝細胞自噬，進而延緩肝細胞衰老，從而減輕NAFLD；且PTUPB 對肝細胞衰老的延緩作用可進一步抑制HSC 活化，從而發揮肝纖維化治療作用[13]。白藜蘆醇激活SIRT1 或過表達SIRT1 和過表達胰島素樣生長因子1 可促進p53 去乙酰化，抑制核p53與早老素相互作用；進而減輕氧化應激引發的肝細胞過早衰老，維持LSEC 開窗，從而改善肝脂肪變性與纖維化[34]。然而，p53 作為DNA 損傷的細胞周期檢查點，其被抑制可能會增加細胞癌變與腫瘤發生的概率，故針對p53 進行治療的強度和時間需要精準把控[35]。另外，單細胞RNA 測序（scRNA-seq）和單細胞核RNA 測序（snRNA-seq）分析表明，熱量限制通過調節肝臟細胞的ATG基因表達可激活自噬以抑制肝臟細胞衰老，故熱量限制可能為未來年齡相關肝病治療新途徑[36]。

3.3 抑制衰老肝臟細胞SASP

甘露聚糖結合凝集素可直接與HSC 細胞表面低密度脂蛋白受體相關蛋白1 相關的鈣網蛋白相互作用，通過上調哺乳動物的雷帕霉素/p53/p21 信號通路誘導活化HSC 衰老，使其增殖減弱、ECM 和SASP成分合成與分泌減少，從而促進肝纖維化消退[32]。然而，盡管誘導HSC 衰老對于減輕肝纖維化有益，但誘導活化的HSC 永久衰老可能會阻礙對于維持肝臟結構與功能至關重要的傷口愈合反應和ECM 維持，故誘導HSC 衰老進行肝纖維化治療的強度和時間是需要考慮的重要問題[37]。CO 依賴性SIRT1 激活促進三四脯氨酸包含在應激顆粒中，進而下調肝細胞中SASP 成分纖溶酶原激活物抑制劑-1 水平，從而減輕肝細胞衰老與NAFLD[38]。但SASP 種類繁多，且衰老肝臟細胞并未被清除仍可繼續分泌SASP 成分，故此治療策略僅可改善癥狀，需與前兩種治療策略相結合以期達到協同治療效果。

4 總結與展望

在與年齡相關肝臟疾病中，肝臟細胞表現出異質性，肝實質細胞和LSEC 具有衰老特征，而HSC和庫普弗細胞雖然數量增加且被激活，但并未發生較多的衰老相關變化。肝臟細胞衰老是一把“雙刃劍”，適度的細胞衰老有益于肝臟結構與功能的維持，并可抑制肝臟細胞癌變與腫瘤的發生，但衰老肝臟細胞的積累則可能是慢性肝病發生與發展的驅動力。此外，近年來scRNA-seq/snRNA-seq 成為高通量組學技術的熱點，其可從基因組學、轉錄組學及蛋白質組學多角度更準確地檢測衰老細胞中多種衰老標志物的組合，這有益于衰老細胞異質性的深入研究與疾病個性化治療。

綜上，肝臟細胞衰老與年齡相關肝臟疾病的發生與發展關系密切，靶向消除衰老肝細胞、延緩肝臟細胞的衰老及抑制衰老肝臟細胞SASP 等治療策略的使用可有效延緩年齡相關肝臟疾病的發生、發展進程；但其之間復雜的機制與關系仍亟待闡明，以肝臟細胞衰老為靶點進行深入探究或成為慢性肝病治療的新方向。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。