左側星狀神經節嗎啡后處理在心肌梗死后重塑中的調節作用

毛 遂,陶 輝,張 野

(安徽醫科大學第二附屬醫院麻醉與圍術期醫學科;安徽醫科大學麻醉與圍術期醫學安徽普通高校重點實驗室,安徽 合肥 230601)

心室重塑是心肌梗死(myocardial infarction,MI)后心力衰竭的主要病理生理機制,其中交感神經的異常激活是引發心室不良重塑的強力驅動因素[1],星狀神經節(stellate ganglion,SG)是頸交感神經系統的一部分,包含支配頭部和頸部的交感神經節前纖維和支配心臟的交感神經節后神經纖維。研究表明急性MI可以誘導SG的神經重塑,另有報道稱超聲引導下注射A型肉毒桿菌毒素可阻斷心臟交感神經節,以改善慢性MI大型動物模型中的心臟重塑[2-3]。這表明SG在交感神經調節心臟活動過程中發揮重要作用,其中左心室的神經調節主要由左側星狀神經節(left stellate ganglion,LSG)調控[4-5]。

嗎啡屬于阿片類鎮痛藥物,因其良好的鎮痛和鎮靜作用,在臨床麻醉中被廣泛應用于心血管手術麻醉和術后鎮痛。研究表明,嗎啡預處理可以明顯減輕大鼠冠狀動脈結扎誘導的局部心肌缺血/再灌注損傷[6];并且在MI嗎啡后處理中改善了大鼠左心室重構和功能障礙[7]。本課題組前期研究發現表明外周和中樞阿片預處理介導了鞘內嗎啡的心肌保護作用[8-9],其機制涉及到SG中交感神經元的興奮性。在此基礎上,本研究擬進一步探討LSG嗎啡后處理在MI后重塑中的調控作用,以期為阿片類藥物心肌保護機制研究提供新的思路和靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康雄性SD大鼠購于河南斯克貝斯生物科技股份有限公司,體質量(220～250)g,實驗動物合格證號為：SYXK(皖)2020-001。大鼠被飼養在安徽醫科大學第二附屬醫院的清潔級動物房中,房間晝夜周期為12/12 h,濕度設置為(40±15)%,環境溫度設置為(22±1) ℃,大鼠可以自由的獲取干凈食物和水,墊料每兩天更換一次。本實驗所有操作符合安徽醫科大學實驗動物倫理委員會要求(編號：LLSC20221128)。

1.2 主要試劑和儀器鹽酸嗎啡注射液(批號：201206,沈陽第一制藥廠);組織裂解液(P0013B)、蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物(P1046)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0010)和抗熒光淬滅封片液(P0131)等均購自上海碧云天生物技術有限公司;GAPDH(60004-1-Ig)抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司;CollagenⅠ(ab260043)、Collagen Ⅲ(ab184993)和MOR(ab10275)抗體購自Abcam公司;Western blot兔二抗(31460)、Western blot鼠二抗(31430)、熒光兔二抗(A-11011)、反轉錄試劑盒(K1622)和總 RNA提取試劑TRIzol購自Thermo公司;ELISA試劑盒(JYM0295Ra)購自武漢基因美公司;SYBR-Green-qPCR標準混合液(RR820A)購自TaKaRa公司。小動物呼吸機(ALC-V8S)購自上海奧爾科特生物科技有限公司;蛋白電泳和轉移設備(1658033)購自Bio-RAD公司;全自動化學發光圖像分析儀(5200)購自上海天能科技有限公司;倒置顯微鏡(Vert.A1)購自蔡司公司;實時熒光定量PCR儀(CFX Connect)購自上海伯樂生命醫學產品有限公司;小動物超聲儀(VINNO 6)購自飛依諾科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1模型的建立 大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉50 mg·kg-1,5 min后待大鼠充分麻醉后,將其固定在手術臺面。胸部剃毛,并用75%酒精消毒3遍,對大鼠進行插管后,使用小動物呼吸機輔助呼吸,呼吸頻率約為70～80次/min,潮氣量約為25～30 mL·kg-1,呼吸比為1 ∶1。隨后在左側胸部平腋下肋間開胸暴露心臟,用6-0帶針線在左心耳下緣2 mm穿過冠狀動脈左前降支,隨后結扎引起冠狀動脈左前降支閉塞,肉眼可見結扎線到心尖部的心肌變白,并且心電圖的Ⅱ導聯顯示ST段抬高。Sham組僅穿線但不結扎。MI+Morphine組在MI手術完成后按照經皮后入路SG阻滯的方式將0.15 g·kg-1嗎啡注入大鼠LSG周圍[10]。具體方法如下,首先觸診大鼠C7棘突作為定位標志點,然后使用1 mL注射器沿C7錐體左側面垂直緩慢刺入,當針尖和錐體失去接觸時,將其撤回約0.5 mm后緩慢注射嗎啡。當大鼠從麻醉中恢復后觀察大鼠有無上瞼下垂等霍納綜合征表現來判斷是否給藥成功[11],在MI后3 d、6 d和9 d按照同樣的方法注射相同劑量的嗎啡。Control組按照同樣方法注射生理鹽水。

1.3.2超聲心動圖 4周后使用飛依諾獸用彩超儀對大鼠心功能進行檢測。首先在B型模式下尋找大鼠心臟,然后切換至M型模式,隨后測量各組大鼠左心室舒張末期內徑( left ventricular internal diameter at end-diastole,LVIDd)、左心室收縮末期內徑( left ventricular internal diameter at end-systole,LVIDs)、左心室射血分數( left ventricular ejection fraction,LVEF)、左心室縮短分數( left ventricular ejection fractional shortening,LVFS)。

1.3.3Masson染色 檢測完超聲后取大鼠心臟組織,使用PBS灌流后放入4%的多聚甲醛中固定,隨后由武漢塞維爾公司專業技術人員進行切片,Masson染色和掃描。使用CaseViewer軟件分析染色結果,ImageJ軟件計算膠原容積分數(collagen volume fraction,CVF ) 。

1.3.4Western blot 取部分MI周圍區組織,加入PIPA裂解液,研磨,離心后得到組織總蛋白。使用BCA試劑盒測定濃度后加入上樣緩沖液,100 ℃金屬浴10 min后自然冷卻10 min,-20 ℃保存待測。取20 ug蛋白進行凝膠電泳,然后轉移到PVDF膜上進行轉膜,把膜放入快速封閉液中封閉30 min。按照蛋白分子量裁出相應蛋白條帶,然后分別放入GAPDH(1 ∶10 000),CollagenⅠ(1 ∶1 000),Collagen Ⅲ(1 ∶1 000)的一抗稀釋液中,4 ℃搖床過夜。TBST洗膜后加入二抗稀釋液,室溫孵育1 h。再次洗膜后滴加顯影液反應1 min,隨后在成像系統上顯出蛋白條帶。

1.3.5實時熒光定量PCR 采用TRIzol法提取部分MI周圍區組織中的總RNA,并逆轉錄成cDNA。使用的引物由上海生工生物工程公司合成,其中ANP上下游引物序列：5′-CGAGAGTCAGGAAACGGAAAG-3′,5′-CTCAGACACACACACACATACA-3′;BNP上下游引物序列： 5′-CACCTCTCAAGTGATCCTGTTT-3′,5′-GCAAGTTTGTGCTGGAAGATAAG-3′;GAPDH上下游引物序列：5′-ACTCCCATTCTTCCACCTTTG-3′,5′-CCCTGTTGCTGTAGCCATATT-3′。在實時熒光定量PCR儀上進行PCR反應,反應條件：95 ℃預變性10 min,95 ℃變性30 s,55 ℃復性30 s,72 ℃延申2 min,總共40個循環。用2-ΔΔCT值法定量目的基因ANP和BNP表達水平。

1.3.6免疫熒光檢測 MI手術后28 d取大鼠LSG組織,4%多聚甲醛4 ℃過夜。0.3 g·L-1的蔗糖對組織脫水24 h,每12 h換液,4 ℃過夜。冰凍切片機將組織切成10 μm厚,放置-20 ℃冰箱保存。取切片,置內源性過氧化氫酶阻斷劑作用15 min,3 mL·L-1Triton X-100作用15 min,胎牛血清37 ℃孵育1 h,一抗4 ℃ 孵育過夜。次日,經PBS沖洗3次,避光加入熒光二抗,37 ℃孵育1 h,PBS沖洗3次,抗熒光淬滅劑封片。顯微鏡下拍照,分析結果。

1.3.7ELISA 在MI后1、3、6、9、28 d尾靜脈取血0.5 mL,冷凍高速離心機3 000 r·min-1離心20 min,取上清,-20 ℃保存待測;超聲檢測后取部分MI周圍區組織,即圍繞病理梗死區域的2 mm區域[12],加入適量PBS,使用研磨儀充分研磨,冷凍高速離心機12 000 r·min-1離心15 min,取上清。按照ELISA試劑盒步驟,首先進行標準品的稀釋和加樣,隨后設置空白孔,接著進行樣品的加樣：首先加入樣品稀釋液40 μL,然后加入待測樣品10 μL。用封板膜封板后37 ℃孵育30 min,重復洗滌5遍,加入顯色劑,37 ℃避光反應10 min,加入終止液,等待15 min后反應終止,隨后立即在酶標儀上450 nm處,檢測各孔A值。

2 結果

2.1 心功能測量大鼠的心臟超聲提示MI后4周,與Sham組相比,MI組大鼠LVIDd和LVIDs均明顯增加(P<0.01);與Control組相比,MI+Morphine組LVIDd(P<0.05)和LVIDs(P<0.01)明顯下降(Fig 1A-C)。與Sham組相比,MI組大鼠LVEF和LVFS明顯下降(P<0.01);與Control組相比,MI+Morphine組LVEF和LVFS明顯增加(P<0.01)(Fig 1D,E)。表明嗎啡后處理對心衰大鼠的心功能有保護作用。

2.2 心肌病理變化取大鼠心臟進行Masson染色來明確大鼠心肌的病理變化。Masson染色結果表明Sham組左心室結構完整,心肌無纖維化改變;MI和Control組心肌纖維化改變明顯,纖維化的程度占整個心室壁約40%,心室壁厚度明顯變薄,并且心室腔擴大明顯;而MI+Morphine組心肌纖維化沉積明顯減少,心室壁厚度增加,心室腔擴大程度減弱(Fig 2A,B)。與Sham組相比,MI組CVF明顯增加(P<0.01);與Control組相比,MI+Morphine組CVF明顯降低(P<0.01)(Fig 2C)。表明嗎啡后處理可以改善MI后心肌的病理變化。

Fig 1 Results of cardiac function in each

Fig 2 Effects of morphine postconditioning on myocardial pathological

2.3 Collagen Ⅰ、Ⅲ以及ANP mNRA和BNP mRNA的表達Western blot結果顯示：與Sham組相比,MI組左心室組織中纖維化蛋白CollagenⅠ、CollagenⅢ的表達明顯增高(P<0.01);與Control組相比,MI+Morphine組左心室組織中纖維化蛋白CollagenⅠ,CollagenⅢ的表達明顯下降(P<0.01)(Fig 3A、3B)。隨后測量心臟組織中心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)和腦鈉肽(brain natriuretic peptide,BNP)的表達變化,二者是衡量心肌肥厚的重要指標。實時熒光定量PCR結果顯示：與Sham組相比,MI組左心室組織中ANP mNRA和BNP mRNA表達量均明顯上調(P<0.01);與Control組相比,MI+Morphine組左心室組織中ANP mNRA和BNP mRNA表達量均明顯降低(P<0.01)(Fig 3C,D)。表明嗎啡后處理可能通過減少心肌纖維化和心肌肥大發揮心肌保護作用。

Fig 3 Effects of morphine postconditioning on myocardial fibrosis protein, ANP mNRA and BNP

2.4 μ阿片受體的表達情況嗎啡作為阿片受體的非特異性激動劑,主要激動μ阿片受體。為探究LSG嗎啡后處理是否通過激動μ阿片受體發揮MI后重塑中的調控作用,本研究采用免疫熒光實驗檢測μ阿片受體在SG中的表達情況。結果顯示μ阿片受體在MI 4周后表達增加(P<0.01);并且在嗎啡后處理后的表達進一步增加(P<0.01)(Fig 4A,B)。

Fig 4 Expression of μ opioid receptor in stellate ganglion detected by

2.5 血漿和心肌中兒茶酚胺濃度阿片類藥物激動阿片受體后可以通過抑制鈣通道內流進而抑制神經元興奮。因此,我們推測LSG嗎啡后處理可能會減少交感神經末梢兒茶酚胺的釋放。本研究使用ELISA試劑盒檢測心衰大鼠血漿和心肌中兒茶酚胺濃度。ELISA結果顯示：在嗎啡后處理的各個時間點,與Sham組相比,MI組血漿中兒茶酚胺濃度明顯增高,并且一直處于相對較高的水平(P<0.01);與Control組相比,MI+Morphine組血漿中兒茶酚胺的濃度明顯降低,并且一直處于相對較低的水平(P<0.01)(Tab 1)。與Sham組相比,MI組4周后梗周區中兒茶酚胺的含量明顯增高(P<0.01);與Control組相比,MI+Morphine組梗周區中兒茶酚胺的含量明顯降低(P<0.01)(Fig 5)。表明嗎啡后處理降低了血漿中和心肌中兒茶酚胺濃度。

Tab 1 Concentration of catecholamine (ng·L-1) in plasma in different

Fig 5 Content of catecholamine in myocardial tissue 28 days

3 討論

MI后心室重塑的發病過程是一個極其復雜的病理生理過程,一直是國內外心臟疾病研究的核心領域。其中有文獻報道,交感神經的異常激活是誘發MI后心肌重塑和室性心律失常的核心效應因素[1]。當MI導致神經損傷時,交感神經異常萌發,并發生區域性(不均勻性)心肌神經支配過度。異常的交感神經激活與電重構心肌之間的耦合導致室性心動過速、室顫和心源性猝死,最終給心臟帶來一系列不可逆的損傷。SG作為調節心臟交感神經活性的通路已經被證明在其中發揮重要作用,但是具體的機制尚不清楚[3]。

本課題組前期研究發現表明外周和中樞阿片預處理介導了鞘內嗎啡的心肌保護作用[8-9],其機制涉及到SG中交感神經元的興奮性。左右SG支配著心臟不同區域的交感神經。目前觀點認為,LSG發出的神經纖維主要支配左心室[4]。在缺血/再灌注損傷的犬模型中,LSG神經活動在MI后立即增加,并且在接下來的8周內繼續增加[5]。臨床手術中LSG切除術已經被證明可以降低MI患者心房顫動的發生[13]。這表明對LSG進行某種干預可能會影響梗死心臟的神經活動。故本實驗采用經皮后入路SG阻滯的方式,將嗎啡注射到MI后大鼠的LSG周圍,觀察LSG嗎啡后處理在MI后重塑中的調控作用。

本研究發現,通過LAD構建MI后心力衰竭的大鼠的心功能水平與Sham組相比出現了明顯的下降;心梗面積顯著增大同時便隨著心肌組織呈現纖維化改變;纖維化蛋白CollagenⅠ和CollagenⅢ的表達明顯增高;心肌組織中ANP mNRA和BNP mRNA表達量均明顯上調。與Control組相比,嗎啡后處理明顯改善了大鼠的心功能,心臟心梗面積減小,心肌組織纖維化沉積減輕,纖維化蛋白CollagenⅠ和CollagenⅢ,ANP mNRA和BNP mRNA表達量也隨之下降。表明嗎啡后處理在MI后心室重塑的過程中有心肌保護作用。

阿片受體是一組以阿片肽為配體的抑制性G蛋白偶聯受體,阿片受體對心血管,呼吸和交感神經等系統具有明顯的調節作用[14]。阿片受體有三種不同的經典受體類型,分別是μ、δ和κ受體。其中嗎啡主要激動μ阿片受體,并且通過激活MOR-1型受體和Nef介導的細胞信號級聯反應調節阿片受體基因轉錄,從而影響μ阿片受體的mRNA剪接,最終影響μ阿片受體的表達[15]。為了進一步探究嗎啡后處理對MI后重塑的心肌保護作用機制,本實驗探究了LSG嗎啡后處理后μ阿片受體的表達變化情況。免疫熒光結果顯示μ阿片受體在MI 4周后SG中表達增加,并且在嗎啡后處理后表達進一步增加,表明嗎啡可能通過激動μ阿片受體發揮心肌保護作用。

交感神經過度激活至少可以導致四種類型的交感神經重塑：MI區交感神經密度減少、梗死周圍區交感神經密度增加、神經遞質或神經肽產生改變以及神經元興奮性增加[16]。其中交感神經主要釋放兒茶酚胺激活心臟上β腎上腺素能受體(β-AR)調節心肌細胞復極化和收縮性,心臟β-AR的激活通過改變跨膜電流和Ca2+穩態調節心肌細胞復極[17]。已有研究表明在突觸前神經末梢,內源性阿片肽或阿片類藥物激動阿片受體后可以有效抑制N型(Cav2.2)和R型(Cav2.3)鈣通道內流,從而抑制神經元興奮[18]。據此,我們推測LSG嗎啡后處理可能會降低交感神經末梢兒茶酚胺的釋放。本研究使用ELISA試劑盒檢測了大鼠血漿和心臟中兒茶酚胺的濃度。實驗結果提示LSG嗎啡后處理減少了交感神經末梢兒茶酚胺的釋放。

綜上所述,LSG嗎啡后處理可以改善MI后心室重塑,其發揮作用的機制可能與嗎啡激動LSG中μ阿片受體,減少交感神經末梢兒茶酚胺釋放有關。