葛根素對妊娠期糖尿病大鼠母體和胎兒的影響

錢 坤,宋祎一,曹 莉

[1. 蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇 蘇州 215123;2. 天大藥業(yè)(珠海)有限公司,廣東 珠海 519070]

妊娠糖尿病(gestational diabetic mellitus,GDM)是指在懷孕期間首次發(fā)病或首次被發(fā)現(xiàn)的碳水化合物不耐受導(dǎo)致的高血糖,是目前妊娠期最常見的并發(fā)癥之一。隨著人們飲食生活習(xí)慣的改變及婚育年齡的推遲,我國GDM的發(fā)病率明顯上升。一份2019年發(fā)表的文獻報告利用Mate分析對2013-2017年報道我國GDM發(fā)生率的25 篇論文進行了進一步匯總分析,統(tǒng)計受試者79 064 名,結(jié)果顯示GDM在中國的發(fā)病率高達12.8%～16.7%[1]。2022年一份對我國41 067 名妊娠婦女的臨床研究報道GDM發(fā)病率為16.3%[2]。GDM不僅可引發(fā)糖尿病并發(fā)癥、妊娠高血壓、羊水過多、胎膜早破、感染、早產(chǎn)、難產(chǎn)等,對母親健康造成嚴重威脅;還易引發(fā)胎兒畸形、缺氧、巨大兒及新生兒呼吸窘迫綜合征、低血糖和其他并發(fā)癥,增加胎兒和新生兒的死亡率[3-4]。因此,GDM的治療及相關(guān)不良妊娠的控制受到廣泛重視。

許多中藥都有調(diào)控血糖的藥效,特別是藥食兩用的葛根廣受關(guān)注。葛根的傳統(tǒng)功效為解肌退熱、生津止渴、升陽止瀉、透發(fā)疹斑等。葛根素(puerarin, Pue )是葛根中提取的一種異黃酮類成分,化學(xué)名為4,7-二羥基-8-β-D-吡喃葡萄糖醛基異黃酮,現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有改善微循環(huán)、抑制醛糖還原酶活性、改善胰島素抵抗和降血糖等作用,在臨床上Pue不僅用于治療冠心病、心絞痛、心肌梗塞,其應(yīng)用于糖尿病及并發(fā)癥的輔助治療也已有30余年的歷史[5-6]。諸多研究者對Pue與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用治療GDM進行了臨床和實驗探索[7]。然而目前單獨評價Pue,特別是口服Pue可否有效控制GDM母體血糖水平,改善妊娠結(jié)局,尚罕見報道。本文建立GDM大鼠模型,觀察口服Pue對GDM母體的療效及對胎兒生長發(fā)育的影響,為臨床用藥提供客觀的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物SPF級SD大鼠,雌性70 只,雄性20 只,體質(zhì)量(250±20) g;由蘇州大學(xué)實驗動物中心提供,生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2007-2008,使用許可證號：SYXK(蘇)2007-0037。SPF動物房環(huán)境溫度(22±2) ℃,相對濕度40%～70%,晝夜交替12 h。

1.2 試劑鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ),BioFroxx 公司(批號：EZ2921B400);Pue,西安艾沃生物科技有限公司(純度：80%,批號：AW-110821);鹽酸二甲雙胍片(metformin, Met)昆山培力藥品有限公司(批號：1112136);50%葡萄糖注射液,中國大冢制藥有限公司(批號：1H89H20);檸檬酸,南京新百藥業(yè)有限公司(批號：0806117);檸檬酸鈉,中諾藥業(yè)有限公司(批號：08089416);戊巴比妥鈉,Sigma 公司(批號：P3761);生理鹽水,山禾齊都藥業(yè)有限公司(批號：15B21121003);4%多聚甲醛通用型組織固定液,蘭杰柯科技有限公司(批號：22343640)、血糖試紙,三諾生物傳感股份有限公司(批號：3824NE)。

1.3 儀器電子天平(上海精天電子儀器有限公司;FA604A)、電子分析天平(Mettler Toledo;ME104)、pH計(Mettler Toledo;Five Easy Plus)、血糖儀(三諾生物傳感股份有限公司,GA-3)。

1.4 方法

1.4.1GDM大鼠模型建立及給藥方案[8]將大鼠按雄雌比例2 ∶1合籠,次晨檢查雌鼠陰道口及籠具底盤,發(fā)現(xiàn)有陰栓者定為妊娠第1天,標記孕鼠,記錄孕期,并將雌、雄鼠分開。除正常對照組外,其余孕鼠用于制備GDM模型：孕鼠妊娠第5晚禁食12 h后,按30 mg·kg-1劑量尾靜脈注射2%的STZ溶液(需用檸檬酸緩沖液新鮮配制：檸檬酸2.1 g加入雙蒸水100 mL中配成A液,檸檬酸鈉2.94 g加入雙蒸水100 mL中配成B液。STZ藥液配制：將A、B液按1 ∶1混合后,調(diào)整pH至4.4,加入STZ配置成2%的STZ溶液)。注射后立即給予大鼠正常供食供水。注射72 h后,用血糖儀檢測孕鼠空腹血糖(提前禁食8 h)?？崭寡?1.3 mmol·L-1以上,且尚未流產(chǎn)者為造模成功。

將造模成功的孕鼠,根據(jù)其空腹血糖,均勻分為模型對照組(Model組)、陽性對照二甲雙胍組(Met組)、葛根素組(Pue組),每組20只。將未造模的10只孕鼠設(shè)為正常對照組(Control組)。各組均按5 ml·kg-1體質(zhì)量連續(xù)灌胃給藥12 d,Met給藥劑量為160 mg·kg-1,Pue給藥劑量為250 mg·kg-1,Model組及Control組均給予等體積蒸餾水。

1.4.2孕鼠空腹血糖監(jiān)測及糖耐量實驗 分別于給藥第5天、第10天檢測尚未流產(chǎn)的孕鼠糖耐量。孕鼠禁食8 h后,按2 g·kg-1的劑量灌胃給予50%葡萄糖溶液,分別于0 min、30 min、60 min、120 min尾靜脈取血,用血糖儀即時檢測各時間點的血糖值(BG),并計算血糖曲線下面積(AUC=(BG 0+BG 30)×0.5/2+(BG 30+BG 60)×0.5/2+(BG 60+BG 120)×0.5/2)。另外,分別于首次給藥前,以及末次給藥1 h后,以同樣方法檢測孕鼠空腹血糖值(見 Fig 1)。

Fig 1 The schematic experimental schedule

1.4.3監(jiān)測孕鼠常規(guī)狀態(tài) 每日記錄孕鼠體質(zhì)量,觀察基本體征,記錄流產(chǎn)情況,計算各組流產(chǎn)率=流產(chǎn)孕鼠只數(shù)/孕鼠總只數(shù)×100%。

1.4.4胎鼠血糖及生長情況檢查 孕鼠妊娠第19晚禁食10 h,次日末次給藥1 h后,麻醉行剖腹產(chǎn),依次剪開孕鼠腹部皮膚、肌肉層、子宮壁、羊膜囊,剝離胎盤,取出胎鼠,觀察畸形情況并計算各組胎鼠宮內(nèi)生長受限發(fā)生率=孕育宮內(nèi)生長受限胎鼠的孕鼠只數(shù)/未流產(chǎn)的孕鼠只數(shù)×100%。稱量胎盤重量、胎鼠的身長(頭頂至尾尖)、尾長(尾根至尾尖)、體質(zhì)量;分離胎鼠心臟、肝臟、腎臟及腦組織。摘取胎心時,將滴出的血液滴入血糖試紙,用血糖儀檢測胎鼠血糖。各臟器用濾紙吸取血液后,稱量重量,并計算臟器指數(shù)=臟器重/體質(zhì)量×100%。

2 結(jié)果

2.1 Pue對GDM孕鼠空腹血糖及糖耐量的影響

結(jié)果僅統(tǒng)計未流產(chǎn)的孕鼠數(shù)據(jù)(Control 組10只, Model組8只,Met組13只,Pue組16只)。給藥治療前,GDM孕鼠空腹血糖明顯高于Control組,有顯著性差異(P<0.01),Model組、Met組、Pue組GDM孕鼠空腹血糖水平相當。給藥后,Met組孕鼠空腹血糖逐漸降低,末次給藥后空腹血糖低于給藥前,有顯著性差異(P<0.01),但仍未降到正常水平;Met組孕鼠末次給藥后空腹血糖與Control組相比有顯著性差異(P<0.01);Pue組孕鼠空腹血糖高的狀況與其給藥前比較,未見明顯改善(P>0.05),但與Model組孕鼠持續(xù)升高的空腹血糖相比,已得到明顯控制,兩組間比較有顯著性差異(P<0.01)(見Fig 2A)。給藥第5天,兩個給藥組孕鼠糖耐量均得到一定程度的改善,AUC均明顯低于Model組,有顯著性差異(P<0.01)(見Fig 2B、2C);給藥第10天,Met組孕鼠糖耐量進一步改善,Pue組則與其第5天相比變化不大(見Fig 2D、2E)。

Fig 2 Effect of oral Pue on fasting blood glucose and glucose tolerance in pregnant rats

2.2 Pue對GDM孕鼠基本體征的影響孕鼠靜脈注射STZ后,體質(zhì)量下降,由于尿量增多,墊料易潮濕并有爛蘋果氣味,毛色失去光澤。隨著孕期延長,各組孕鼠的平均體質(zhì)量均有所增加。但在妊娠末期(妊娠第19天),GDM各組孕鼠體質(zhì)量均明顯低于Control組,具有顯著性差異(P<0.01),且體質(zhì)量個體差異大,其主要原因是GDM引起的流產(chǎn)導(dǎo)致孕鼠體質(zhì)量突然下降,這種情況在Model組尤為明顯(見Fig 3A)。將各組未流產(chǎn)的孕鼠和中途流產(chǎn)的孕鼠體質(zhì)量分開統(tǒng)計,則Model組未流產(chǎn)孕鼠體質(zhì)量較Control組略有增高,而流產(chǎn)鼠體質(zhì)量則低于其自身孕初期體質(zhì)量;兩個給藥治療組未流產(chǎn)孕鼠體質(zhì)量明顯小于Control組和Model組,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01),而這兩個給藥組流產(chǎn)鼠的體質(zhì)量則較Model組流產(chǎn)孕鼠明顯增加,且均有顯著性差異(P<0.05,P<0.01),兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見Fig 3B)。

Fig 3 Effect of oral Pue on body weight of pregnant rats

2.3 Pue對GDM孕鼠流產(chǎn)率的影響各組GDM孕鼠均有流產(chǎn)現(xiàn)象,流產(chǎn)后有的尚可見子宮內(nèi)留存有胎盤,有的子宮內(nèi)已無殘留,僅見子宮供血血管依舊擴張充盈(見Fig 4A、4B)。Control組無孕鼠流產(chǎn);Pue組孕鼠流產(chǎn)率為20%,僅為Model組孕鼠流產(chǎn)率(達60%)的1/3,比Met組(孕鼠流產(chǎn)率為35%)降低了15%(見Fig 4C)。

Fig 4 Effect of oral Pue on rate of abortion in pregnant rats

2.4 Pue對GDM胎鼠血糖及宮內(nèi)生長受限的影響在妊娠第20天,對孕鼠行剖腹產(chǎn)。在部分孕鼠子宮內(nèi)發(fā)現(xiàn)有宮內(nèi)生長受限胎鼠(體質(zhì)量<1 g,且身體顏色明顯偏黃),Model組宮內(nèi)生長受限發(fā)生率達62.5%,Pue組為56.3%,Met組為30.8%(見Fig 5A、5B),Control組未見宮內(nèi)生長受限胎鼠。胎鼠血糖僅統(tǒng)計無生長受限的胎鼠。Model組胎鼠血糖明顯高于Control組,有顯著性差異(P<0.01);Pue組胎鼠血糖值較Model組降低明顯,有顯著性差異(P<0.01),但仍明顯高于Control組,差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);而Met組胎鼠血糖不僅明顯低于Model組,甚至低于Control組,且均有顯著性差異(P<0.01),見Fig 5C。

Fig 5 Effect of oral Pue on blood glucose and growth restriction in fetal rats

2.5 Pue對GDM胎鼠生長發(fā)育的影響胎鼠數(shù)據(jù)僅統(tǒng)計無生長受限的胎鼠。GDM各組胎盤重量較Control組明顯增加,具有顯著性差異(P<0.05),各給藥組與Model組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見Fig 6A);Model組胎鼠體質(zhì)量、身長都大于Control組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),Met組和Pue組胎鼠體質(zhì)量和身長均接近Control組,明顯低于Model組,有顯著性差異(P<0.01);Pue組胎鼠體質(zhì)量偏輕,身長較短,但與Control組和Met組比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見Fig 6A、6B)。

Fig 6 Effect of oral Pue on body weight, placenta weight, body length and tail length in fetal rats

與Control組胎鼠相比,Model組胎鼠的腦重指數(shù)明顯降低,組間比較差異顯著(P<0.01);心重指數(shù)和肝重指數(shù)也呈現(xiàn)一定的降低趨勢,腎重指數(shù)則表現(xiàn)出一定升高,但都與Control組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與Model組胎鼠相比,Met組和Pue組胎鼠腦重指數(shù)均明顯增加,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05,P<0.01),其中Pue組更接近Control組水平。Pue組胎鼠心重指數(shù)和肝重指數(shù)較Model組增高明顯,具有顯著性差異(P<0.05,P<0.01)(見 Tab 1)。

Tab 1 Effect of oral Pue on organ indices of heart, liver, kidney and brain in fetal

3 討論

妊娠期母體在多種激素的相互作用和能量代謝明顯改變的狀況下,更容易發(fā)生胰島素抵抗和糖代謝異常,進而引發(fā)糖尿病,約50%的GDM孕婦會成為終身糖尿病患者[9]。此外,GDM孕婦感染、妊高征、酮癥酸中毒的患病率明顯高于正常孕婦,同時羊水量異常、胎盤早剝、流產(chǎn)、早產(chǎn);胎兒畸形、宮內(nèi)發(fā)育遲緩、巨大兒,以及新生兒死亡等不良妊娠結(jié)局的發(fā)生率均明顯增加[10-11]。有些嬰兒即使在出生時未表現(xiàn)出明顯異常,然而其一些重要臟器的功能卻潛在諸多患病風(fēng)險[12]。因此,對GDM的治療不僅要控制孕婦的血糖水平,改善其胰島素敏感性;更應(yīng)降低孕婦及胎兒GDM相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生。我國2022版《妊娠期高血糖診治指南》[13]和美國2023版指南(《糖尿病分類與診斷》《妊娠期糖尿病管理》)在GDM藥物治療上均建議把胰島素作為治療GDM的首選藥物[14-15]。然而,GDM患者對注射的給藥方式接受度不高,而口服用藥則具有更高的依從性。

有臨床研究者利用Mate分析比較三種降糖藥(胰島素、甘布瑞德和Met)用于GDM的有效性和安全性,結(jié)果顯示：與甘布瑞德和胰島素相比,Met不僅能顯著降低母親餐后血糖水平及新生兒進入新生兒重癥監(jiān)護室的比例,而且新生兒體質(zhì)量明顯下降[16]。但本實驗結(jié)果顯示：雖然Met確實可以降低GDM流產(chǎn)率和胎兒宮內(nèi)生長受限發(fā)生率,但卻可引起胎鼠血糖顯著低于正常胎鼠。葡萄糖是妊娠期胎兒能量的主要來源,因此這一點不該被忽視。這與中美指南中指出的Met和格列本脲都可通過胎盤屏障影響胎兒,存在潛在的風(fēng)險是一致的[13-15]。同樣其他口服化學(xué)降糖藥物也都缺乏長期安全性數(shù)據(jù)。因此,很多研究者和臨床醫(yī)生期望在中藥中尋找治療GDM安全有效的口服藥物。

Pue就是目標之一[17],然而Pue用于治療GDM的療效和安全性同樣有待深入研究。本文通過尾靜脈注射STZ的方法建立GDM大鼠模型,從孕鼠和胎鼠兩個角度,比較全面地評估了口服Pue治療GDM及干預(yù)其妊娠結(jié)局的作用。實驗結(jié)果顯示：口服Pue確實可以顯著緩解GDM持續(xù)升高的空腹血糖,改善其糖耐量,雖然在降低孕鼠和胎鼠血糖方面效果不如Met;但在降低流產(chǎn)率和緩解GDM導(dǎo)致的母體體質(zhì)量過度增加方面則優(yōu)于Met。這提示Pue降低GDM流產(chǎn)率和控制母體體質(zhì)量方面的作用機制不僅僅是控制血糖和改善糖代謝,很可能與其改善微循環(huán)和抑制炎癥應(yīng)激等機制有關(guān)[17-18]。Pue組胎鼠的血糖顯著低于Model組,但仍高于正常胎鼠。該結(jié)果提示：由于Pue干預(yù)母體血糖效果并不算理想,以及其在改善子宮內(nèi)膜微循環(huán)方面的潛在機制,使胎鼠血糖未得到很好的控制。另外,Pue組孕鼠的流產(chǎn)率雖然最低,但胎兒宮內(nèi)生長受限發(fā)生率卻接近Model組,這說明Pue在改善胎盤功能方面療效也算不理想。但在無生長受限的胎鼠生長發(fā)育的相關(guān)指標上,口服Pue卻表現(xiàn)出減少巨大兒的發(fā)生,促進胎兒重要臟器的發(fā)育的作用。Model組胎鼠,體質(zhì)量和身長均顯著高于Control組,這與臨床上GDM巨大兒發(fā)生率高是一致的;Met組和Pue組胎鼠體質(zhì)量和身長均接近Control組;GDM各組胎盤重量都顯著高于Control組,但Pue組最接近于Control組。進一步稱取胎鼠的心、肝、腎、腦等重要臟器,計算并比較臟器指數(shù)可初步判斷這些器官的發(fā)育情況。Model組胎鼠腦的臟器指數(shù)顯著低于Control組,摘取臟器時,也明顯發(fā)覺Model組胎鼠較其他組胎鼠的腦組織更軟嫩易碎;而Met組和Pue組胎腦的臟器指數(shù)均顯著高于Model組,且Pue組胎腦無論是臟器指數(shù)還是質(zhì)地都更接近于正常胎鼠。Model組胎鼠心、肝、腎的臟器指數(shù)與Control組比較雖無統(tǒng)計學(xué)意義,但也表現(xiàn)出一定的變化趨勢,即：心、肝的臟器指數(shù)降低,而腎的臟器指數(shù)升高;這些趨勢在Met組和Pue組均得到了明顯的緩解。對胎鼠腦、心、肝、腎進行石蠟切片和HE染色,未能發(fā)現(xiàn)組織形態(tài)學(xué)上明顯的差異,這可能與石蠟切片制備過程中多次脫水有關(guān)。這些結(jié)果提示：Pue可明顯改善GDM引起的胎兒重要臟器發(fā)育異常,降低其日后潛在患病風(fēng)險。

綜上所述,單獨口服降糖藥用于治療GDM,無論是西藥的Met還是中藥中提取的Pue,均未能達到十分令人滿意的療效,盡管其中的機制尚不清楚,且大鼠與人之間存在種屬差異,但本實驗結(jié)果仍可給臨床用藥提供一定的有價值的參考。中美兩國指南中均指出70%～85%的GDM患者可以僅通過改變生活方式控制血糖水平,對GDM孕婦進行健康管理可改善妊娠結(jié)局(證據(jù)等級A級)[13-15]。近一步結(jié)合本文實驗結(jié)果,提示：根據(jù)GDM患者病情和胎兒發(fā)育情況,確定不同方案的綜合療法更為可行。