基于蛋白質組學探討羥基-α-山椒素對糖尿病心肌病的作用機制

王 雪,黃 碩,楊 羚,肖雯婧,呼永河

(1.成都中醫藥大學臨床醫學院,四川 成都 610072;2．中國人民解放軍西部戰區總醫院,四川 成都 610083)

國際糖尿病聯盟(The International Diabetes Federation, IDF)發布的第10版《IDF全球糖尿病地圖》顯示,全球有5.37億成年人(20-79歲)患有糖尿病,預計到2030年這一數字增至6.43億,2045年將增至7.84億,糖尿病已成為威脅人口健康的重要問題[1]。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病的重要并發癥,是導致糖尿病患者死亡的主要原因之一[2]。臨床治療 DCM策略以控制血糖為主,缺乏針對性治療方案。中醫藥治療糖尿病及其并發癥具有悠久歷史,近年來已發現多個中藥及其有效成分對DCM具有治療潛力[3]。

蜀椒即為四川省特產川花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.),近年來,關于川花椒治療心血管疾病的藥用價值,逐漸受到關注[4]。故課題組在烏頭赤石脂丸基礎上重用蜀椒加減形成臨床經驗方“舒心湯”。課題組前期建立DCM藥效學體內外驗證模型實驗結果顯示,使用舒心湯治療后,可明顯提高高糖損傷心肌細胞存活率,改善DCM鼠的心功能。我們證明課題組經驗方舒心湯對DCM具有治療作用,并在該方指導下研究DCM針對性候選藥物。川花椒作為舒心湯的“君藥”,在疾病治療中發揮主要作用,山椒素類化合物是川花椒最主要的功能性組分之一,是其麻味來源,并對心臟有保護作用,能明顯改善糖尿病所致心肌病[5]。此外,研究發現羥基-α-山椒素(hydroxy-α-sanshool,SAN)可改善糖尿病鼠的蛋白紊亂、脂質紊亂及肥胖,但對DCM的療效觀察及保護機制尚不清楚[6]。因此本次研究主要探究SAN治療DCM小鼠的療效,差異蛋白表達情況及參與的保護機制,并對相關通路的關鍵蛋白表達量進行Western blot驗證。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級健康雄性C57BL/6小鼠24只,7～8周齡,體質量(20±2)g,購自成都達碩實驗動物有限公司,生產許可證號SCXK(川)2020-030。24只小鼠隨機分組分籠喂養,自由獲得食物和水,明暗周期各12 h,室溫維持24 ℃。

1.2 藥物及試劑STZ(S110910)購自北京索萊寶科技有限公司;SAN(純度≥98.00%,分子式C16H25NO2,分子量263.375;DQ0175)購自成都德思特生物技術有限公司;SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(P0015F),BCA定量試劑盒(P0012)購自上海碧云天生物技術有限公司;Tris(T0826-500g),BSA(A0332)購自上海生工生物工程有限共司;碘乙酰胺(I1149-5G)、三氟乙酸(T6508)和二硫蘇糖醇(43819-5G)均購自美國Sigma公司;甲酸(A117)購自美國Thermo Fisher Scientific;乙腈(1000304008)購自美國Merck;HCl(10011018)購自國藥集團化學試劑有限公司;Trypsin(V5117)購自美國Promega;cAMP抗體(DF6523)、PKA抗體(AF7746)和HRP標記山羊抗兔二抗(S0002)購自常州市祥泰生物技術有限公司。

1.3 儀器Easy nLC色譜系統(美國Thermo Fisher Scientific);低溫高速離心機(德國Eppendorf 5430R);電泳儀(美國BIO-RAD);超聲破碎儀(寧波新芝JY96-IIN);Orbitrap Exploris 480質譜儀(美國Thermo Fisher Scientific);Multiskcan FC酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific);真空離心濃縮儀(太倉華美LNG-T98);MP Fastprep-24勻漿儀(美國MP Fastprep-24 5G)。

1.4 方法

1.4.1DCM模型的建立、分組及給藥 24只小鼠適應性飼養1周后,隨機分為對照組(CON組)、DCM組和SAN治療組(DCM+SAN組),每組8只小鼠。CON組普通飼料喂養,DCM組和DCM+SAN組高脂飼料(脂肪、蛋白質、碳水化合物)喂養。4周后,DCM組和DCM+SAN組禁食不禁水12 h,連續7 d腹腔注射STZ(50 mg·kg-1),CON組小鼠注射等體積溶媒(檸檬酸鹽緩沖液,pH 4.5)。注射7 d后禁食12 h尾靜脈采血,測空腹血糖≥11.1 mmol·L-1視為誘導糖尿病成功,繼續飼養10周使其發展為DCM[7]。造模成功后,DCM+SAN組通過灌胃給藥(8 mg·kg-1,蓖麻油作為溶媒灌胃),其余兩組以等體積蓖麻油灌胃,持續給藥4周[6]。

1.4.2血糖測定、心臟超聲 實驗開始每周測1次空腹血糖直至結束。藥物干預結束后,異氟烷呼吸麻醉小鼠行心臟超聲檢測,對心臟左室收縮及舒張末期的容積及內徑進行測量,計算左室射血分數(left ventricular ejection fractions, LVEF)和左室縮短分數(left ventricular fractional shortening,LVFS)。

1.4.3心臟取材 超聲結束12 h內腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉小鼠,生理鹽水清洗并分離心臟,一部分心肌組織放入4%多聚甲醛固定以備觀察病理形態,另一部分凍存于-80 ℃冰箱用于蛋白組學及Western blot檢測。

1.4.4心肌組織病理形態觀察 取固定的心臟組織進行脫水,固定,石蠟包埋,切片(4 μm),采用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining,HE)染色,完成后中性樹膠封片,顯微鏡下觀察心肌組織的病理形態變化并拍照。

1.4.5檢測蛋白質酶解肽段 取凍存心臟組織剪碎加入適量SDT裂解液后勻漿破碎,沸水浴10 min,冷卻后低溫離心取上清液,將取得樣本用BCA法進行蛋白定量,計算相應蛋白濃度。樣品蛋白加上樣緩沖液,沸水浴后進行SDS-PAGE電泳。質檢合格后進行蛋白過濾器輔助樣品制備(filter-aided sample preparation, FASP)酶解：加入二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT)進行肽段還原,之后加入碘乙酰胺(IAA)進行烷基化,尿素及置換buffer分別置換3次進行超濾。最后肽段凍干后加入甲酸溶液復溶用于后續檢測。

1.4.6液相色譜-質譜連用分析 采用納升流速Easy nLC系統進行色譜分離。A液為0.1%甲酸水溶液,B液為0.1%甲酸乙腈水溶液。色譜柱(C18分析柱：IonOpticks, Australia,25 cm×75 μm,1.6 μm,C18beads)以100%的A液平衡,樣品由自動上樣器上樣到分析柱分離,流速為300 nL·min-1。設置液相梯度：1.5 h梯度：0～2 min,B液4%～6%;2～75 min,B液線性梯度從6%～28%;75 min～80 min,B液線性梯度從28%～38%;80 min～85 min,B液線性梯度從38%～100%;85 min～90 min,B液維持在100%。樣品經色譜分離后直接進行質譜分析。一級質譜分辨率為120 000,AGC target為300%,一級Maximum IT為50 ms。二級質譜分辨率15 000,Microscans為1,二級Maximum IT為35 ms。

1.4.7生物信息學分析 將實驗所得蛋白質數據與swissprot數據庫中蛋白質數據信息進行定量蛋白比對分析,得出不同組別差異蛋白。篩選樣本組內重復實驗數據中至少有一半為非空值的數據進行統計分析,以fold change≥1.2(上下調)且t test<0.05為篩選標準篩選差異表達蛋白質[8]。對樣品和差異蛋白質的表達量兩個維度進行分類,并生成層次聚類熱圖。利用Blast2Go數據庫(https：//www.blast2go.com/)進行基因本體(gene ontology,GO)功能二級注釋分析。使用KEGG數據庫(https：//www.genome.jp/kegg/)進行京都基因和基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析。運用string網站(https：//string-db.org/)及cytoscape軟件對關鍵通路差異表達蛋白進行蛋白質互作網絡分析。

1.4.8Western blot驗證cAMP信號通路關鍵蛋白表達水平 將小鼠心臟組織進行總蛋白提取,BCA蛋白定量法測定蛋白濃度。制膠,上樣,電泳(80 V 0.5 h,120 V 1 h),切膠,轉膜(300 mA,1.4 h),5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,一抗室溫孵育1 h后4 ℃過夜,次日取出PVDF膜,TBST清洗后(5 min/次,3次)加入山羊抗兔Ⅱ抗孵育1 h,TBST清洗(5 min·次-1,3次),加入顯影液顯影并利用UVP成像儀拍照。ImageJ軟件計算條帶灰度值,半定量分析后比較各組差異。

2 結果

2.1 各組小鼠血糖及心功能變化與CON組相比,DCM組與DCM+SAN組小鼠血糖明顯升高并≥11.1 mmol·L-1(P<0.01);SAN干預結束后(20 weeks),小鼠血糖無明顯變化;SAN持續給藥干預處理后,觀察小鼠心臟LVFS和LVEF變化,超聲顯示與CON組相比,DCM組LVFS和LVEF明顯降低(P<0.05);與DCM組相比,DCM+SAN組小鼠LVFS和LVEF明顯升高(P<0.05)(Fig 1)。表明,SAN未能明顯改善小鼠的血糖,但對心功能有保護作用。

Fig 1 Effect of hydroxy-α-sanshool on cardiac dysfunction and blood glucose caused by diabetes mellitus

2.2 SAN對小鼠心肌組織病理學形態的影響HE染色顯示,CON組小鼠心肌組織整齊排列,層次鮮明,組織結構清洗可見。DCM組小鼠心肌組織排列紊亂,細胞肥大變形且大小不一,組織結構模糊、稀疏。DCM+SAN組小鼠心肌組織排列紊亂及細胞肥大得到明顯改善,組織結構較DCM組更為清晰(Fig 2)。表明,SAN對DCM小鼠的心肌組織具有保護作用。

Fig 2 Hydroxy-α-sanshool ameliorated diabetes-inducedmyocardial histopathology (100 μm)

2.3 心臟蛋白濃度測定及SDS-PAGE檢測電泳結果顯示,電泳條帶清晰,平行性好,無蛋白降解(Fig 3)。表明樣本蛋白滿足后續開展蛋白定量實驗。

Fig 3 SDS-PAGE gel map of cardiac sample

2.4 SAN對DCM小鼠模型差異表達蛋白的影響為了篩選DCM小鼠使用SAN治療與否心臟組織中的差異蛋白,將實驗數據和數據庫對比,共鑒定出160個差異表達蛋白,其中127個蛋白發生表達上調,33個蛋白發生表達下調,按照差異表達進行火山圖可視化;將蛋白質相對表達數據進行分層聚類分析并在熱圖中可視化(Fig 4)證實蛋白質的合理性獲取。

Fig 4 Statistics of differentially expressed proteins in cardiactissue of mice in DCM group and DCM+SAN group

2.5 SAN對DCM小鼠模型差異蛋白富集到GO功能二級注釋中的影響根據GO富集分析結果,展示DCM組與DCM + SAN組在GO功能二級注釋的結果(Fig 5)。主要生物過程主要有：細胞過程(cellular process),生物調節(biological regulation),代謝過程(metabolic process),細胞成分組織或生物成因(cellular component organization or biogenesis),對刺激的反應(response to stimulus)。主要分子結構主要有：黏合物(binding),催化活性(catalytic activity),分子功能調節器(molecular function regulator)。主要細胞結構主要有細胞部分(cell part),細胞器部分(organelle part),細胞器(organelle),含有蛋白質的復合體(protein-containing complex)。

Fig 5 Secondary annotation diagram of GO function of differentially expressed proteins

2.6 SAN對DCM小鼠模型差異表達富集到KEGG的影響以KEGG通路為單位,將篩選出的差異蛋白進行Fisher′s精確檢驗,根據相應的P-value(-log10)得分及富集的蛋白數量對疾病和功能進行排序,以區分這些蛋白質與不同疾病和功能之間的相關性或重要性(Fig 6)。對前20種疾病和功能進行展示,結果顯示cAMP信號通路(cAMP signaling pathway)排名最高(Tab 1);以cAMP信號通路為對象,展示通路中相應蛋白變化情況(Fig 7)。結果表明,cAMP信號通路可能是SAN對DCM小鼠有效作用的最重要機制之一。

Tab 1 Ranking of diseases and functions affected by hydroxy-α-sanshool according to Fisher′s exact test algorithm

Fig 6 KEGG enrichment analysis of differentially expressed proteins

Fig 7 The pathway diagram of cAMP signaling pathway KEGG Red represents the differentially expressed proteins of change

2.7 SAN對DCM小鼠模型差異表達蛋白互作網絡分析利用String數據庫對cAMP信號通路上的差異蛋白進行網絡互作分析,再用cytoscape 軟件根據蛋白互作間的度值進行可視化。PKA與其他明顯差異表達的蛋白顯示出最多的相互作用(Fig 8)。結果表明,PKA是cAMP信號通路上的核心蛋白。

Fig 8 Analysis diagram of cAMP signaling pathwayprotein interaction network

2.8 Western blot驗證cAMP、PKA蛋白表達水平DCM組小鼠心肌組織中的cAMP和PKA蛋白相對表達量均明顯低于CON組(P<0.05);DCM+SAN組小鼠心肌組織中的cAMP和PKA蛋白相對表達量均明顯高于DCM組(P<0.05)(Fig 9)。

Fig 9 Western blot changes in expressionof differentially expressed proteins

3 討論

山椒素是脂肪鏈酰胺生物堿,有廣泛的生物學效應,其中SAN在花椒中含量為71.75～191.65 mg·g-1[9]。藥代動力學數據顯示,健康受試者口服或皮下注射SAN后,可迅速吸收、分布,SAN口服30 min后,血漿SAN濃度達到最大值,為0.76～2.66 μmol·L-1,半衰期為1.6～1.7 h,藥代動力學擬合后呈線性[10]。

生物信息學推測SAN可能通過cAMP信號通路保護糖尿病心功能。研究發現通過激活cAMP信號通路,對DCM、心臟衰竭和心肌缺血再灌注等多種疾病有保護作用[11-12]。cAMP是心臟細胞中的中樞第二信使,也是心臟病理生理的關鍵調節分子,正常的心臟功能通過調控cAMP合成和降解之間的平衡來嚴格控制細胞內cAMP濃度[13-14]。cAMP信號通路是經典的G蛋白偶聯受體通路,調節和測量心肌cAMP的鈣調素和其他調節蛋白。其在調節心肌細胞功能的不同方面起著關鍵作用,包括基因轉錄、細胞代謝和介導心臟興奮-收縮耦連。此外,細胞外刺激,如神經遞質、激素、趨化因子、脂質介質和藥物,可以通過與大量跨膜G蛋白偶聯受體結合來調節腺酰環化酶的活性,從而增加或減少cAMP的產生達到對心臟收縮功能的調節[11]。

通過建立DCM小鼠模型,證實SAN對糖尿病心功能有保護作用,能明顯改善糖尿病所致心臟功能及結構的損傷。利用蛋白質組學技術對DCM小鼠使用SAN治療與否心臟組織中的差異蛋白進行檢測,再對差異蛋白進行生物信息學分析。GO 富集分析結果表明,差異蛋白主要參與細胞過程、代謝過程、對刺激的反應等過程,大部分位于細胞器及含有蛋白質的復合體;KEGG通路分析,差異蛋白涉及的cAMP信號通路富集最豐富,可能是SAN保護DCM小鼠的最重要機制之一;蛋白互作確定了cAMP信號通路上的關鍵蛋白及蛋白間互作關系。通過Western blot驗證cAMP、PKA及所在通路可能參與了SAN對DCM的保護作用。為精確闡釋SAN對DCM的作用機制,課題組將進一步驗證相關通路具體互作機制通路的作用,以助力于對DCM治療開發新的靶點及藥物。