SIRT1/Nrf2/HO-1通路在七氟烷后處理改善失血性休克復(fù)蘇小鼠空間學(xué)習(xí)與記憶障礙中的作用

牛志倫,張 麗,胡 溯,吳雨潔,萬曉靜,胡憲文

(安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉與圍術(shù)期醫(yī)學(xué)科,安徽 合肥 230601)

失血性休克嚴(yán)重危害人類生命健康。治療失血性休克臨床常用辦法是液體治療,盡快補充循環(huán)血量,但常會誘發(fā)腦缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷,出現(xiàn)組織和細(xì)胞損害[1]。研究報道,七氟烷能減輕腦I/R損傷[2]。本課題組前期研究證實[3],七氟烷后處理通過增加沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulation 1,SIRT1)表達(dá),緩解再灌注后小鼠海馬神經(jīng)元線粒體功能損傷,改善認(rèn)知水平,但其發(fā)揮作用的確切機制尚不清楚。腦再灌注損傷涉及多種因素,其中活性氧(reactive oxygen species,ROS)的過量產(chǎn)生會引起組織多糖、蛋白質(zhì)和腦脂質(zhì)的氧化應(yīng)激損傷,進(jìn)一步造成細(xì)胞死亡和神經(jīng)系統(tǒng)功能損害[4]。因此,本研究以氧化應(yīng)激為切入點,探索七氟烷緩解腦I/R損傷的機制和路徑。

SIRT1的神經(jīng)保護作用已在腦I/R中得到證實[3]。近年來,有研究發(fā)現(xiàn)SIRT1可以激活核因子E2相關(guān)因子2(nuclear transcription factor E2 related factor 2,Nrf2),減少線粒體氧化應(yīng)激,增加ATP產(chǎn)生,使線粒體膜電位正常化,進(jìn)而減少I/R時的氧化損傷[5-6]。亦有研究證明,Nrf2可以促進(jìn)抗氧化因子血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1,HO-1)表達(dá),降低缺氧/復(fù)氧時細(xì)胞凋亡率和線粒體ROS水平,發(fā)揮抗氧化作用[7-8]。基于SIRT1/Nrf2/HO-1信號通路在I/R事件中的積極作用,本研究擬觀察七氟烷后處理是否通過SIRT1/Nrf2/HO-1通路,改善失血性休克復(fù)蘇小鼠氧化應(yīng)激與空間學(xué)習(xí)記憶障礙,為臨床預(yù)防I/R腦損傷提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 8～10周齡的健康C57BL/6J小鼠,♂,由安徽醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供,動物生產(chǎn)許可證號：SYXK(皖) 2020-0005。

1.1.2試劑 七氟烷(貨號：83291),購自AbbVie公司;SIRT1抑制劑EX527(貨號：CSN10146),購自CSNpharm公司;Nrf2抑制劑ML385(貨號：B8300),購自美國APExBIO公司;SIRT1抗體(貨號：ab110304)、HO-1抗體(貨號：ab189491),均購自Abcam公司;Nrf2抗體(貨號：AF0639)、ECL顯影液(貨號：KF8003),均購自Affinity公司;ATP試劑盒(貨號：S0026),購自碧云天生物技術(shù)有限公司;ROS、丙二醛(malonaldehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒(貨號：E004-1、A003-1、A001-3),均購自南京建成生物工程研究所。

1.1.3儀器 七氟烷蒸發(fā)罐(Drager公司);RSP01雙向全自動輸液泵(嘉興貝塔儀器有限公司);水迷宮實驗分析系統(tǒng)(深圳市瑞沃德公司);Tanon-4600SF凝膠成像儀(上海天能科技公司);Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技公司);氣體檢測儀(深圳邁瑞生物公司)。

1.2 方法

1.2.1動物分組與小鼠失血性休克復(fù)蘇模型的制備 將小鼠隨機分為5組：假手術(shù)組(Sham組)、失血性休克與復(fù)蘇組(HSR組)、七氟烷后處理組(Sevo組)、Sevo+EX527組、Sevo+ML385組,每組16只。小鼠麻醉前禁食12 h,自由飲水。腹腔注射1%戊巴比妥(50 mL·kg-1)麻醉,保持自主呼吸,仰臥位固定。將PE10管置入小鼠右頸總動脈和頸靜脈,完成后將300 U·kg-1的肝素輸入小鼠靜脈觀察10 min,然后將連接導(dǎo)管的1 mL注射器裝入注射泵,使用注射泵從小鼠動脈持續(xù)抽血30 min,總體積是小鼠40%總血容量。失血1 h后,將血液經(jīng)右頸靜脈于30 min內(nèi)重新注射入小鼠體內(nèi),完成失血性休克和復(fù)蘇術(shù)。Sham組僅在動靜脈中置入PE10管,不抽血。Sevo組先進(jìn)行抽血,回輸血液時吸入由95% O2、5% CO2帶動的七氟烷,七氟烷呼氣末濃度為2.4%。Sham組和HSR組在同樣節(jié)點吸入95% O2、5% CO2混合氣30 min。Sevo+EX527組于置入導(dǎo)管前30 min由腹腔注射SIRT1抑制劑EX527(10 mg·kg-1)。Sevo+ML385組于置管前30 min由腹腔注射Nrf2抑制劑ML385(30 mg·kg-1),其余操作同Sevo組。

1.2.2小鼠空間與學(xué)習(xí)記憶能力測定 各組剩余小鼠于術(shù)后4～10 d實施水迷宮測試。小鼠每日進(jìn)行4次練習(xí),使小鼠朝向水池壁,依次選取Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限送進(jìn)水池,統(tǒng)計1 min內(nèi)到達(dá)平臺的時間為逃避潛伏期。如小鼠沒能到達(dá)平臺,在人為幫助下游向平臺并等候10 s,此次測試成績?yōu)?0 s。兩次訓(xùn)練相隔20 min,當(dāng)天潛伏期為4次測試的平均值,共訓(xùn)練6 d。d 7將平臺移除,讓小鼠自行游動60 s,記錄小鼠目標(biāo)象限路程及穿越平臺的次數(shù),測試在每日13 ∶00-17 ∶00之間進(jìn)行。

1.2.3海馬組織ATP含量測定 I/R術(shù)后24 h,各組取6只小鼠的右側(cè)海馬組織用于ATP、ROS、MDA和SOD檢測,置于-80 ℃冰箱凍存。組織加入裂解液勻漿后,離心取上清。依照ATP檢測說明書操作。將標(biāo)準(zhǔn)品按照需要配制成一定的濃度梯度,每孔加100 μL稀釋后的ATP檢測工作液,然后向檢測孔中添加20 μL待測樣品或標(biāo)準(zhǔn)品,放入酶標(biāo)儀,使用化學(xué)發(fā)光檢測每孔相對光單位(relative light unit,RLU)值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得出組織中ATP水平,除以上清液中蛋白濃度得出相對ATP含量。

1.2.4海馬組織ROS含量測定 取海馬組織剪碎,用PBS沖洗1遍。加入一定量酶消化液,消化20 min,而后使用尼龍網(wǎng)濾過組織,離心收集沉淀。將DCFH-DA與沉淀混勻,置于水浴鍋中孵育30 min。收集孵育后的懸液,離心收集沉淀,洗去殘余的DCFH-DA。離心,收集沉淀,用PBS重懸,使用多功能酶標(biāo)儀測定其熒光信號。

1.2.5MDA和SOD含量測定 稱取海馬組織,加入一定量生理鹽水制備勻漿,離心取上清,檢測上清液蛋白濃度。依據(jù)試劑盒操作步驟,檢測海馬組織MDA和SOD水平。

1.2.6Western blot法檢測蛋白的表達(dá) 水迷宮實驗完成后,取海馬組織加入裂解液,加入磁珠研磨,冰上放置充分裂解,離心取上清,測蛋白濃度。取20 μg組織蛋白進(jìn)行PAGE凝膠電泳,200 mA電流轉(zhuǎn)移至膜上,快速封閉液封閉20 min,將膜加入對應(yīng)一抗中孵育過夜,再加入二抗繼續(xù)孵育1 h。滴加顯影液,采用凝膠成像儀化學(xué)發(fā)光顯影,蛋白條帶相對灰度值利用ImageJ軟件測定。

2 結(jié)果

2.1 七氟烷對小鼠潛伏期的影響如Fig 1所示,與HSR組相比,水迷宮實驗第4、5、6天,Sham組和Sevo組小鼠潛伏時間明顯縮短(P<0.01);與Sevo組比較,Sevo+EX527組和Sevo+ML385組小鼠潛伏時間延長(P<0.01)。提示EX527和ML385逆轉(zhuǎn)了七氟烷后處理對小鼠認(rèn)知功能的保護作用。

Fig 1 Effect of sevoflurane on latency n=10)

2.2 七氟烷對小鼠目標(biāo)象限路程與穿越平臺次數(shù)影響如Fig 2所示,與HSR組比較,Sham組和Sevo組小鼠平臺象限運動距離及穿越平臺次數(shù)明顯增加(P<0.05,P<0.01);與Sevo組比較,Sevo+EX527組和Sevo+ML385組小鼠平臺象限運動距離及穿越平臺次數(shù)明顯降低(P<0.01)。上述結(jié)果表明,七氟烷后處理對小鼠認(rèn)知功能的保護與SIRT1和Nrf2相關(guān)。

Fig 2 Effect of sevoflurane on target quadrant distance and crossing platform n=10)

2.3 七氟烷對海馬ATP和ROS含量影響Fig 3結(jié)果顯示,與HSR組比較,Sham組和Sevo組小鼠海馬ATP含量明顯增加,ROS含量明顯減少(P<0.01);與Sevo組比較,Sevo+EX527組和Sevo+ML385組小鼠海馬ATP含量明顯降低,ROS含量明顯升高(P<0.01)。提示EX527和ML385逆轉(zhuǎn)了七氟烷后處理ATP和ROS水平。

Fig 3 Effect of sevoflurane on ATP (A) and ROS (B) contents in n=6)

2.4 七氟烷對海馬SOD和MDA水平影響如Fig 4所示,與HSR組相比,Sham組和Sevo組SOD活性增加,MDA含量降低(P<0.05,P<0.01);與Sevo組相比,Sevo+EX527組和Sevo+ML385組SOD活性降低,MDA含量升高(P<0.05)。提示SIRT1、Nrf2介導(dǎo)七氟烷后處理對小鼠的抗氧化作用。

Fig 4 Effects of sevoflurane on SOD activity (A) and MDA content (B) in n=6)

2.5 SIRT1、Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)情況如Fig 5所示,與HSR組比較,Sham組和七氟烷組小鼠海馬SIRT1、Nrf2和HO-1表達(dá)上調(diào)(P<0.01);與七氟烷組比較,Sevo+EX527組和Sevo+ML385組小鼠海馬上述蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05,P<0.01);Sevo+ML385組與七氟烷組比,SIRT1蛋白含量差異無顯著性。表明七氟烷后處理通過SIRT1/Nrf2/HO-1通路,發(fā)揮對I/R小鼠的保護作用。

Fig 5 Results of protein expression in five n=3)

3 討論

研究表明,失血性休克再灌注后表現(xiàn)為炎癥因子大量釋放、細(xì)胞凋亡、血腦屏障破壞等,會加劇缺血后腦組織和神經(jīng)元的損傷[9]。Shi等[10]發(fā)現(xiàn),七氟烷后處理可以減輕失血性休克復(fù)蘇后大鼠的腦梗死面積、神經(jīng)細(xì)胞凋亡和認(rèn)知功能障礙。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn),七氟烷后處理可以改善腦I/R小鼠學(xué)習(xí)記憶能力[3]。研究證實,腦I/R損傷與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。在發(fā)生組織再灌注損傷的過程中,釋放的大量ROS會使呼吸鏈復(fù)合物的功能失活,而呼吸鏈的損傷進(jìn)一步增加ROS的產(chǎn)生和積累,觸發(fā)一系列的細(xì)胞氧化損傷[11]。SOD是一種內(nèi)源性抗氧化酶,能夠抑制機體的氧化應(yīng)激反應(yīng)。MDA是生物體氧化應(yīng)激的代謝產(chǎn)物,能夠反映脂質(zhì)過氧化的水平。因而,SOD的活性以及MDA的含量可以提示氧化損傷的水平。有研究表明,七氟烷后處理通過激活A(yù)kt/mTOR信號,改善線粒體損傷,增加SOD活性,降低MDA含量,降低線粒體ROS的產(chǎn)生,促進(jìn)ATP的合成,減輕氧化應(yīng)激來保護大鼠心臟免受I/R損傷[12]。本研究發(fā)現(xiàn),七氟烷后處理使I/R小鼠海馬ROS、MDA含量減少,ATP含量和SOD活性升高,說明七氟烷后處理具有減輕失血性休克后海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激的作用。

SIRT1可以在多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中對蛋白質(zhì)底物進(jìn)行去乙酰化,調(diào)控基因表達(dá)、控制細(xì)胞周期進(jìn)程,具有保護神經(jīng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝和氧化應(yīng)激的作用[13]。本課題組前期實驗利用小鼠失血性休克與復(fù)蘇模型,證實了七氟烷后處理通過增加SIRT1表達(dá),減少失血性休克再灌注小鼠海馬神經(jīng)元的凋亡[3]。SIRT1蛋白的升高可以緩解神經(jīng)元的變性,降低促炎因子水平和線粒體損傷,減輕腦I/R損傷[14]。Song等[15]利用短暫性大腦中動脈閉塞實驗證實,促進(jìn)SIRT1表達(dá)可以改善I/R后小鼠神經(jīng)元損傷和細(xì)胞凋亡,抑制氧化應(yīng)激。本實驗通過對七氟烷后處理小鼠注射SIRT1抑制劑EX527來減弱SIRT1的表達(dá),小鼠行為學(xué)測試的潛伏期明顯延長,目標(biāo)象限路程及穿越平臺次數(shù)明顯減少;海馬組織ROS、MDA含量升高,ATP水平和SOD活性降低,表明SIRT1參與七氟烷后處理改善腦I/R小鼠氧化應(yīng)激和空間學(xué)習(xí)與記憶能力。

近年來,有研究指出SIRT1被激活后,可以通過促進(jìn)Nrf2的表達(dá)改善氧化水平[16]。Nrf2是細(xì)胞對抗氧化損傷和保持氧化還原穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵分子之一,Wang等[7]的研究表明,Nrf2可以通過促進(jìn)HO-1的表達(dá),抑制氧化應(yīng)激引起的I/R損傷。本實驗中,HSR組小鼠海馬組織SIRT1、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)減少,七氟烷后處理上調(diào)了SIRT1、Nrf2的表達(dá),并促進(jìn)了其下游抗氧化蛋白HO-1的表達(dá)。相反,通過注射SIRT1抑制劑EX527降低了七氟烷后處理對蛋白表達(dá)的上調(diào)作用。

研究表明,HO-1能夠維持I/R大鼠血腦屏障的完整性,緩解腦I/R后的繼發(fā)性腦損傷和認(rèn)知功能障礙[17]。HO-1可以提高線粒體膜電位,降低線粒體氧化產(chǎn)物,來抵御缺氧/復(fù)氧對細(xì)胞產(chǎn)生的氧化損害[8]。HO-1的缺失可以加重氧化應(yīng)激損傷,而HO-1基因被激活后,可以改善氧化應(yīng)激引起的復(fù)合物的功能障礙,增加線粒體內(nèi)ATP的水平[18]。本研究在七氟烷后處理的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步使用ML385抑制小鼠中Nrf2的表達(dá),發(fā)現(xiàn)小鼠海馬組織中Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)有明顯減少,而SIRT1的表達(dá)與Sevo組比沒有明顯變化;ATP含量及SOD活性降低,MDA、ROS含量升高。同時,小鼠逃避潛伏期明顯增加,平臺象限運動距離及越過平臺次數(shù)減少。這些結(jié)果證明,七氟烷后處理可能通過激活SIRT1/Nrf2/HO-1信號通路,減少氧化應(yīng)激,進(jìn)而減輕腦I/R損傷。

綜上所述,七氟烷后處理可以通過增加SIRT1、Nrf2的表達(dá),進(jìn)一步活化HO-1,減輕氧化應(yīng)激,從而減少腦I/R損傷,改善小鼠的空間學(xué)習(xí)與記憶能力。