中性蛋白酶高溫酶解條件下豬糞資源化利用中養分的變化規律

戴鵬飛 孫權 解昊郡 王銳 蔣鵬

摘要? 以酶工程及酶動力學為技術依托及科學依據，將豬糞加玉米秸稈組合作為底物，添加2%中性蛋白酶，在生化反應釜中80 ℃酶解3 h，底物含水量降低至56.01%，同比下降2.34%；大分子有機質含量降低至63.79%，酶解后，A、B處理的底物有機質含量分別降低了14.19%、15.06%；植物可利用大量元素提高至6.87%，符合NY 525—2012有機肥標準；速效磷、速效鉀、全鹽、總腐殖酸呈下降趨勢；蛔蟲卵死亡率達到92%，種子發芽指數達到54%，達到有機肥腐熟標準。

關鍵詞? 豬糞；中性蛋白酶；高溫酶解；有機肥；養分；變化規律

中圖分類號? S141.2? 文獻標識碼? A

文章編號? 0517-6611（2024）04-0051-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.04.011

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Changes Rule of Nutrients During the Resource Utilization of Pig Manure Under High Temperature Enzymatic Hydrolysis with Neutral Protease

DAI Peng.fei，SUN Quan，XIE Hao.jun et al

（College of Agriculture，Ningxia University，Yinchuan，Ningxia 750021）

Abstract? Based on enzyme engineering and enzyme kinetics as the technical support and scientific basis，the combination of pig manure and corn stover was used as the substrate，2% neutral protease was added，and the water content of the substrate was reduced to 56.01% at 80°C for 3 h in a biochemical reactor，a year.on.year decrease of 2.34%.The content of macromolecular organic matter was reduced to 63.79%，and after enzymatic hydrolysis，the organic content of substrates treated A and B reached 14.19% and 15.06%，respectively.The use of a large number of elements in plants had been increased to 6.87%，which met the NY 525-2012 organic fertilizer standard.Available.available phosphorus，available potassium，total salt and total humic acid showed a downward trend.The mortality rate of roundworm eggs reached 92%，and the seed germination index reached 54%，which reached the standard of organic fertilizer rot.

Key words? Pig manure;Neutral protease;High temperature enzymatic hydrolysis;Organic fertilizer;Nutrient;Change rule

基金項目? 寧夏回族自治區重點研發計劃項目（2019BCF01001，2022BEG02004）。

作者簡介? 戴鵬飛 （1998—），男，寧夏固原人，碩士研究生，研究方向：農業資源利用。*通信作者，教授，博士，博士生導師，從事農業資源和環境教學與科研工作。

收稿日期? 2023-03-02

促進畜禽糞污資源化性質開發利用，是實現本地畜禽生產可持續發展的必然選擇，是農產品資源環境保護既是農業生產的重要物質基礎，也是我國農產品質量安全的根本保證，隨著我國人口增加、生活膳食方式的轉型以及農村城市化持續推進，我國農產品需求量持續剛性上升，同時民眾對自然環境以及農產品安全的需求也日益提高，對維護中國農產品資源環境保護制度提出了更高需求。畜禽飼養產生的糞污中包括了大量的氮、磷物質以及病菌、寄生蟲，不僅是農作物面源環境污染的主要污染源，還危害到了養殖戶身邊的自然環境，甚至危害市民的健康，因此畜禽飼養所產生的糞污已經形成了實現畜禽飼養可持續發展最大的環境障礙［1］。我國作為畜禽養殖大國，龐大的養殖規模下產生的大量養殖糞污是造成農業面源污染的主要來源［2］。未經處理的畜禽糞污在儲存過程中還會釋放大量有毒氣體［3］。同時，畜禽糞便作為一種有機固體廢棄物，富含氮、磷、鉀和有機物等營養元素，也是農業生產中的重要肥料資源［4］。好氧堆肥是實現畜禽糞便無害化與資源化的生物轉化技術［5］，有利于肥料中養分的保持，是我國目前糞便處理的主要方式［6］。堆肥后所得的肥料施于土壤，可以改良土壤，提高土壤肥力，對降低環境壓力和實現畜禽養殖業可持續發展具有十分重要的意義［7］。然而，傳統的好氧堆肥技術依然存在一些問題，如堆肥時間長、有機物降解不完全、腐殖化程度低、氨氣揮發、溫室氣體釋放和重金屬活性高等，這些問題不僅會降低堆肥品質，造成二次污染，還會阻礙堆肥產業化的發展［8-9］。

已有部分研究指出，添加不同輔助堆肥材料不僅能夠滿足微生物發酵所需的水、氣、溫，還能提高發酵速度，降低臭氣及氮素損失等［10-11］。陳云峰等［12］研究表明，添加碳酸鹽巖能促進堆肥發酵；吳曉東等［13］研究發現添加檸條生物炭可以縮短堆肥升溫期1～2 d，延長堆肥高溫期的停留天數2～4 d，提高堆肥質量；徐榮等［14］通過研究篩選出了綠色安全的堆肥添加劑聚天冬氨酸，其對堆肥過程具有氮素固持和重金屬鈍化的綜合作用。而中性蛋白酶在畜禽糞便堆肥中的應用研究較少，因此，探究中性蛋白酶在堆肥中的應用效果能夠為畜禽糞污資源化利用提供一定的理論依據。該研究采用全封閉發酵裝置，以玉米秸稈為輔料，引進臺灣楊秋忠院士發明的糞污酵素發酵技術，以產品理化性狀作為評價標準，探究在添加中性蛋白酶高溫酶解下豬糞資源化利用中養分的變化規律。

1? 材料與方法

1.1? 供試原料? 供試生豬糞購自養豬場，玉米秸稈購自農戶。堆肥添加劑為地天泰農業生技股份有限公司提供的中性蛋白酶ME-101（農業用酵素）。物料理化性質見表1。

1.2? 酶解堆肥裝置

試驗采用地天泰農業生技股份有限公司的全封閉發酵裝置進行高溫酶解堆肥，利用電熱棒加熱生物油，生物油供給物料熱能量。主體結構裝置示意圖如圖1所示，整個裝置為臥式反應罐鋼架結構，外壁設有隔熱層25 mm，生產罐圓柱體長2.5 m，直徑1.1 m，有效容積為85%，罐體由電機旋轉，酶解發酵攪拌轉速為4.6 r/min，內壁設有螺旋式推進裝置。

1.3? 酶解方法

試驗于2020年5月中旬在寧夏吳忠市紅寺堡金宇浩興養殖基地進行。該試驗設置2個處理，處理A

不添加中性蛋白酶為對照，處理B為添加中性蛋白酶。將生豬糞和玉米秸稈按C/N=25∶1混合，再用去離子水調節混合物料含水量至60%，根據物料總量為150 kg，添加3.75 kg中性蛋白酶ME-101（用量為25 kg/t）。各處理不同原料添加量見表2，后開啟攪拌旋轉控制開關開始升溫酶解，總酶解時間為3 h。

1.4? 采樣和測定指標及方法

采用五點取樣法采集酶解樣品，采取時間為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h的樣品，每份取樣500 g裝于自封袋，一半于4 ℃條件下保存，另一半自然風干粉碎過篩備用。每隔0.5 h測定肥堆上、中、下3個層次的溫度，并記錄室溫。同時采集鋁盒1/3體積的新鮮樣品測定含水率。將新鮮堆肥樣品與水按1∶10（質量體積比）比例混合振蕩2 h，上清液測定pH和電導率。有機質、全氮、全磷、全鉀的測定方法參考國標NY 525—2012［15］。 速效氮、速效磷和速效鉀的含量分別采用堿解擴散法、碳酸氫鈉提取-鉬銻抗比色法、乙酸銨浸提-火焰光度法測定［16］。

種子發芽率的測定參考文獻［17］。蛔蟲死亡率的測定參考文獻［18］。總腐殖酸采用焦磷酸鈉浸提-重鉻酸鉀容量法測定［19］。

1.5? 數據統計

試驗數據使用Excel 2010整理與作圖，SPSS 20.0軟件進行顯著性檢驗，顯著性水平為P<0.05。測定結果均以平均值±標準誤的形式表示。

2? 結果與分析

2.1? 酶解過程中物料溫度的變化

在限定物料溫度（80 ℃）和油浴加熱溫度（120 ℃）下，各處理物料在20 min時均可達到高溫發酵溫度，油浴30 min后溫度均可到達100 ℃以上，高溫可以保證供應物料酶解腐熟的熱能量。

2.2? 酶解前后總腐殖酸含量的變化

腐殖酸含量是影響物料腐熟度及其農用效果的重要參數，如圖2所示，A、B處理的總腐殖酸含量均呈先升高后降低的趨勢，在1.0 h之前，處理B的總腐殖酸含量高于處理A，處理A在1.5 h時達到最大值（20.61%），處理B在1.0 h時達到最大值（21.29%）。酶解3.0 h時處理A總腐殖酸含量較酶解前（0 h）提高了40.25%，處理B的總腐殖酸含量較酶解前降低了11.57%。腐殖酸中部分易降解物質被微生物分解后，腐殖酸降解量大于其合成量，使得后期腐殖酸含量逐漸下降。

2.3? 酶解前后蛔蟲卵死亡率的變化

從表3可以看出，酶解后各處理的蛔蟲卵死亡率均較酶解前有所提高，其中處理B提高最明顯，較酶解前提高了48.39%；處理A酶解后的蛔蟲卵死亡率較酶解前提高了23.08%。說明中性蛋白酶能促進物料的腐熟進程。

2.4? 酶解前后種子發芽指數（GI）的變化

種子發芽指數（GI）可直接反映酶解物料的腐熟程度。從表4可以看出，高溫酶解后不同處理種子發芽指數較酶解前差異明顯，各處理酶解后的種子發芽指數均較酶解前的高，處理B提高最明顯，提高了1.57倍。而處理A提高并不明顯，可能是由于酶解過程中處理A中不斷累積的無機鹽離子含量過高，從而對種子發芽產生了抑制作用。

2.5? 酶解后各處理營養成分比較

從表5可以看出，處理B的有機質相比于處理A提高了54.64%，全氮、全磷和全鉀含量均高于處理A，分別提高了21.43%、37.61%、268.70%，總養分含量也達到了6.87%。

2.6? 酶解過程中堆體含水量、pH和電導率的變化? 在堆肥過程中，物料含水量的變化與微生物活動和溫度都密切相關，適當的含水量能提高堆肥的效果，堆肥的最佳初始含水量在55%～65%。如圖3a所示，在酶解開始時，A、B處理的初始含水量均較高，分別為56.15%、57.29%，隨著酶解的進行，A處理含水率在0～2 h呈現降低趨勢，在2～3 h略有上升趨勢，在2 h處達到最低點，其值為55.10%。B處理在0～1 h 呈現逐步降低趨勢，且在0～1 h下降趨勢較大，在1～2 h呈現先上升后下降的趨勢，2～3 h也呈現先上升后下降的趨勢，在3 h處達到最低點，為56.01%，還沒有達到NY 525—2021有機肥標準，后期還需要經過一段時間的晾干。

電導率反映堆肥物料中可溶性鹽的含量，是判斷堆肥腐熟的必要條件，腐熟后的產品中無機鹽離子是植物生長發育所必需物質之一。如圖3 b所示，隨著酶解的進行，A、B處理的電導率均呈升高趨勢。酶解結束后，A、B處理的電導率分別為1.78、4.92 mS/cm，分別較初始時提高了52.14%、35.91%。

如圖3c所示，處理A的pH變化不大，趨于穩定，酶解前后的pH分別為8.27和8.33。處理B的pH總體呈下降趨勢，酶解前后的pH分別為8.14和7.01。引起pH降低的主要原因可能是物料結構較致密，不能為微生物提供充足的含氮有機物和氧氣，造成局部厭氧而導致有機酸積累，并最終導致pH降低。而在1.5～2.0 h，pH出現了小幅度的升高，這是由于酶解中期物料溫度較高，微生物代謝蛋白質的活動增強，從而導致氨氮不斷產生，最終表現為pH升高。

2.7? 酶解過程中物料全量養分含量的變化? 物料中的N、P、K的含量決定了物料的利用價值。有機質含量變化反映微生物對纖維素和半纖維素的分解形成腐殖物質的能力。從表6可以看出，A處理的有機質含量在各個時間段低于B處理，說明中性蛋白酶有助于纖維素類物質（玉米秸稈）降解，對于有機質含量具有提升作用，并隨著時間段推移，A、B處理的有機質含量均呈逐漸降低，酶解3.0 h時A、B處理的有機質含量分別較酶解前降低了14.19%、15.06%。各處理在酶解3.0 h時有機質含量均達到NY 525-2012有機肥標準。

A、B處理的全氮含量均呈現“升高—降低”的往復循環變化，且升降幅度越來越小，B處理的波動性變化周期更短，B處理的全氮含量大于A處理，酶解3.0 h時A、B處理的全氮含量分別較酶解前降低了16.00%、24.44%；酶解技術發酵氮素損失較低，氮素損失較低的原因可能是封閉裝置酶解，接觸氧氣較少，銨態氮散失能力降低。整個酶解過程都在高溫期，隨著有機質的腐質化，消耗大量能量，氮素損失能量降低。酶解結束后，不同類肥酶解處理全氮含量損失極低，說明添加中性蛋白酶的處理均能起到保氮效果。

A處理全磷含量在酶解條件下呈現先降低后上升的趨勢；B處理的全磷含量呈現先降低后上升的趨勢，在2.5 h時達到最大值；B處理各時間段全磷含量均大于A處理，酶解3.0 h時，A處理全磷含量較酶解前升高了15.84%，B處理全磷含量較酶解前降低了10.56%。B處理各時間段

全鉀含量均大于A處理，酶解3.0 h時，A處理全鉀含量較酶解前升高了64.29%，B處理全鉀含量較酶解前降低了36.62%；鉀素與磷素性質一致，在酶解發酵過程中，不會因為溫度原因和形態轉換揮發損失，全鉀含量的提升與養分濃縮效益密切相關。

2.8? 酶解過程中物料速效養分含量的變化

從圖4可以看出，酶解結束后，處理A、Ｂ的速效氮含量低于酶解開始時的含量，A、B處理的速效氮含量分別較初始降低了58.33%、20.35%。

處理A的速效磷含量變化不明顯，酶解1.5 h時較酶解前僅提高了5.15%；處理B的速效磷含量變化幅度很大，在0.5 h急劇下降并逐漸趨于平穩，在2.0 h達到最小值（2.08 g/kg），酶解3.0 h時較酶解前降低了35.23%。

相對于處理B，處理A的速效鉀含量變化趨勢較平穩，酶解3.0 h時較酶解前提高了7.69%；處理B的速效鉀含量變化明顯，在1.5 h時達到最大值（8.65 g/kg），而后又逐漸降低，酶解結束后速效鉀含量為7.58 g/kg，較酶解前降低了8.67%。

3? 討論

吳曉東等［13］研究表明在第40天時，添加生物炭可以使雞糞堆肥產品的水分含量降低至40%左右。該研究結果表明，酶解結束后A、B處理的含水量分別為55.30%、56.01%，這可能是由于物料種類不同造成的，同時這與NY 525—2012標準的含水量（30%）還有較大差距，說明短時間酶解發酵難以降低底物含水量。陳云峰等［12］研究表明，添加碳酸鹽巖的豬糞堆肥電導率下降了27.3%，而在該試驗結果中，酶解后處理B的電導率較酶解前提高了35.91%，這可能是由于酶解過程中，中性蛋白酶促進了物料有機質的降解，產生了大量有機鹽類所引起的。堆體pH的變化主要是由酶解過程中物料發酵所產生的有機酸、氨類成分及其蛋白質所共同引起的。在該研究中處理B的pH明顯低于對照，這與徐榮等［14］關于添加聚天冬氨酸會降低堆肥產品pH的研究結果相似。說明在堆肥中添加中性蛋白酶等有機物質有助于降低物料的pH。

經過高溫酶解后，A、B處理的有機質含量分別降低至41.25%、63.79%，酶解過程中，各處理有機質含量降低，這可能是由于物料中微生物分解有機物作為其能源并釋放CO2所造成的［20-21］。添加中性蛋白酶處理（處理B）的有機質含量明顯高于對照（處理A），這與李太魁等［22］關于添加生物炭堆肥能提高堆肥有機質含量的研究結果一致。酶解3.0 h時處理A、B的全氮含量較酶解前均降低，這是由含氮有機物被微生物分解形成氨氣揮發導致氮損失所導致的［23］。有研究表明，堆肥會促進無機磷、鉀向有機磷、鉀的轉換［24］，處理B在酶解3.0 h時全磷、全鉀含量均有所降低。這可能是由于中性蛋白酶促進了物料中無機磷、鉀向有機磷、鉀的轉化。酶解后添加中性蛋白酶處理的總養分含量顯著高于對照，且達到了有機肥標準，這與李太魁等［22］的研究結果一致，說明添加中性蛋白酶也可以有效改善堆肥的質量。在該研究結果中，處理B酶解3.0 h時的速效養分含量較酶解前低，且速效氮、磷、鉀的含量分別降低了20.35%、35.23%、8.67%。氮是微生物主要營養來源，氮含量的變化直接反映出微生物的活動狀況。添加中性蛋白酶處理的速效氮含量降低，氮素損失明顯，這與周文兵等［25］的研究結果一致；速效磷、速效鉀含量的降低情況與前人的研究結果［25］相反，其具體機理還有待進一步研究。

有研究表明，隨著堆肥發酵的進行，木質纖維素降解形成腐殖酸，大分子腐殖酸被降解和轉化為小分子有機物，同時堆肥腐殖酸中含量豐富的氨基酸易被生物降解和利用，其含量隨著發酵的進行呈下降趨勢［26］，因此在堆肥過程中腐殖酸的含量是逐漸降低的。該研究結果表明，酶解后添加中性蛋白酶處理的總腐殖酸含量明顯降低。這也說明中性蛋白酶對腐殖酸的降解有一定的促進作用。試驗結果表明，酶解后添加中性蛋白酶處理的蛔蟲卵死亡率達92%，顯著高于對照，達到了畜禽糞便無害化衛生標準中蛔蟲卵死亡率（95%～100%）的要求。種子萌發指數與堆肥產品對植物的毒害性呈負相關，當堆肥產品的種子發芽指數大于70%時則可以達到無害化要求［20］。在該研究中，酶解結束后，添加中性蛋白酶處理的種子發芽指數明顯高于對照，但是僅為54%，仍低于標準水平，這與酶解時間過短有關。

4? 結論

畜禽糞便中含有非常豐富的氮、磷、鉀等營養元素及大量的有機物質，是非常寶貴的肥料資源。該研究通過添加中性蛋白酶在高溫酶解下，將糞污資源化利用，旨在減少其污染程度，改變其中的養分含量，為寧夏養殖業的糞污處理提出理論指導，并得出以下結論：

（１）在該研究中，添加中性蛋白酶處理的含水量較高，但未達到 NY 525—2021標準，需進一步優化；pH和電導率的變化都在合理范圍內。

（２）有機質含量、全量養分含量達到了有機肥標準，速效養分含量明顯高于對照。

（３）高溫酶解發酵結束后，添加中性蛋白酶處理的總腐殖酸含量明顯降低，蛔蟲卵死亡率達到畜禽糞便無害化衛生標準，種子發芽指數表明酶解產品達到對植物無毒害的標準。

（４）各項研究結果表明，研究添加中性蛋白酶可以加快堆肥進程，堆肥后的產品能基本達到腐熟標準。

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