枯草芽孢桿菌同源重組表達外源基因在畜牧業應用的研究進展

趙蓀琦，張明輝，高學軍

長江大學動物科學技術學院，湖北荊州 434023

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一種從土壤中分離的革蘭氏陽性桿狀細菌，被美國食品和藥物管理局（FDA）認可為GRAS（Generally recognized as safe）菌株。作為益生菌，枯草芽孢桿菌在動物飼料、水產養殖、植物病害防治等方面應用前景廣闊，常作為飼料添加劑提高動物抗病力，改善動物腸道微生物平衡[1]。因其強大的蛋白質分泌能力和完善的遺傳操作系統，近年來被廣泛應用為生成外源蛋白的基層宿主。本文進一步介紹了枯草芽孢桿菌分泌系統、啟動子、質粒載體、轉化方法，以及利用同源重組表達外源基因在畜牧業應用的研究進展。

1 枯草芽孢桿菌表達與分泌系統

枯草芽孢桿菌是目前背景最為詳細的革蘭氏陽性細菌之一，已成為基因工程菌的熱門。

1.1 表達系統

枯草芽孢桿菌表達系統的主要優勢有：①屬于GRAS 菌株，無致病性；②細胞壁主要成分為肽聚糖和磷壁酸，不含有脂多糖，即內毒素。在分泌蛋白時不會產生有害物質；③抗逆性強，培養需求容易滿足，生長速度快；④有全基因組測序，遺傳背景清晰，無明顯的密碼子偏好，不會因稀有密碼子出現蛋白表達量降低、翻譯提前終止等問題；⑤擁有胞外蛋白分泌系統，能夠高效正確地表達外源基因。

目前枯草芽孢桿菌表達系統也存在一定缺陷：①枯草芽孢桿菌的感受態細胞制備較為困難，轉化成功率低；②枯草芽孢桿菌會分泌大量蛋白酶，導致外源基因的產量下降?？莶菅挎邨U菌產生至少8 種細胞外蛋白酶，有很高的降解異源分泌蛋白的傾向，導致目標產物的巨大損失。為了解決這一問題，人們通過滅活蛋白酶基因構建了幾種胞外蛋白酶活性降低的枯草桿菌宿主，包括1A751、WB600、WB700、WB800 等；③部分外源蛋白在培養基中的分泌會影響枯草芽孢桿菌自身生長；④枯草芽孢桿菌存在的多種修復系統導致質粒穩定性下降，易丟失[2]。

1.2 分泌系統

枯草芽孢桿菌僅有一層細胞膜，分泌的蛋白質無須轉位至周質空間即可經過細胞膜到達胞外。依據應用分泌元件、翻譯轉運偶聯程度、切割信號肽酶等方面的不同，可將其分泌途徑分為4 種：Sec 轉運酶-SRP（Signal recognition particle)聯合操作途徑、雙精氨酸轉運（twin-arginine transport）、ABC（ATP-binding cassette）轉運子途徑和網絡蛋白（Pseudopilin）分泌途徑。

為了提高蛋白表達，人們開發了許多基因調控策略和表達系統，其中信號肽工程已成為近年來促進重組蛋白分泌的主要策略。研究表明，對相應的信號肽或宿主細胞自身蛋白分泌系統進行篩選和改造，可以提高蛋白質的分泌，優化目的蛋白的生產[3]。

1.3 啟動子

用于生產異源蛋白的啟動子要求高強度，使得重組蛋白的產量更高。許多天然、人工啟動子已成功用于枯草芽孢桿菌中重組蛋白的表達，目前枯草芽孢桿菌表達系統的啟動子有：P43、Pgrac、Pxyl、PspoVG、PbltD、PabrB、PBH4、PsrfA、Pveg、PserA、PymdA、PaprE、Pspac、PsacB、PT7、PyxiE等。

研究結果表明，雙啟動子可以進一步提高酶在枯草芽孢桿菌中的過表達。通過克勞桿菌堿性絲氨酸蛋白酶在枯草芽孢桿菌中篩選出的最優啟動子PBsamy-PBaamy 雙啟動子，胞外酶活性達27860U/mL。

1.4 表達載體

目前枯草芽孢桿菌表達系統中常用的表達載體有游離型質粒載體和整合型質粒載體?？莶菅挎邨U菌常用的游離型質粒有pHT43、pMA0911、pUB110、pLS1、pMAD、pE194、pAMβ1、pSB6、pTB19、pC194 等。

1.5 轉化體系

細菌細胞的人工轉化包括兩個過程：①獲得適應外源DNA 的能力（感受態細胞）；②在特定刺激下將外源遺傳物質吸收到細胞中。目前枯草芽孢桿菌常用的感受態制備及轉化方法有：高滲透電穿孔法、SP 法、GM 法、EGTA 改良的低鹽環境饑餓法等[4]。

2 枯草芽孢桿菌同源重組

質粒介導的重組蛋白在細菌中的生產是不穩定的，尤其是在后期發酵過程中?；谌旧w整合的同源重組表達外源基因方法比基于質粒的方法具有優勢。研究學者發現通過染色體整合獲得的百菌清水解脫鹵酶（Chd）和甲基對硫磷水解酶（MPH）活性分別比質粒介導表達的活性高300倍和5.3 倍。研究學者通過染色體整合ipaH 基因在枯草芽孢桿菌中成功表達，其表達出的異菌二酮水解酶（IpaH）活性高達213.26U/mL，比pet29a 質粒介導的表達高21 倍。

2.1 整合載體

整合型質粒載體通過攜帶外源基因表達片段插入到宿主菌染色體內從而達到復制效果，可以保持外源基因的穩定性。通常包含以下部分：大腸桿菌的復制子，抗生素抗性基因，可表達外源蛋白的目的基因，一或兩段上下游同源臂。枯草芽孢桿菌整合型質粒有：pMutin-GFP+、pSG1151、pSG1156、pDG364、pDG1664、pMutin4、pHY300PLK、pDL、pDK 等[5]。

2.2 整合位點

相關研究表明，基因在染色體上的位置會顯著影響基因的表達水平。研究學者發現在大腸桿菌中，靠近復制起點的基因最大表達水平約是靠近復制終點基因的9 倍?？莶菅挎邨U菌中常用的基因插入位點有thrC、amyE、sacA、lacA 等。

2.3 影響因素

除整合位點外，同源重組的整合過程、整合效率和整合基因表達水平還受到諸多因素調控。雙交換整合的質粒需要400 ～500bp 的同源臂長度來提高整合效率。研究學者分離鑒定了14 種不同的枯草芽孢桿菌DNA 修復和重組缺陷突變體，并對它們的染色體和質粒轉化效率進行比較。研究學者發現，MutS2 的缺失會導致質粒和染色體DNA 的轉化效率降低，并通過實驗結果推斷MutS2可以促進枯草芽孢桿菌的同源重組。

3 枯草芽孢桿菌同源重組在畜牧業的應用

通過生物技術表達外源基因可以使益生菌進行更多成分例如酶、抗菌肽、富含限制性氨基酸多肽、有益代謝產物等的高效表達，從而進一步提高畜禽生產效率。目前枯草芽孢桿菌同源重組在畜牧業的應用尚處于起步階段，以下綜述了已有相關報道。

3.1 同源重組表達抗菌肽

抗菌肽作在畜牧業中具有廣闊應用前景，其作為飼料添加劑不但可以提高生產性能、維持動物腸道健康，還可以在一定程度上代替抗生素。雖然抗菌肽具有很高的經濟價值，但生產中存在產率低、提取工藝繁瑣等問題。外源表達技術具有生產成本低、生產周期短、提取工藝簡單、易于獲得高產率等優點，為提高抗菌肽的產量提供了有效途徑。

研究學者通過同源重組法構建了異源表達桿菌肽生物合成操縱子的枯草芽孢桿菌菌株KE360，重組菌高水平合成了支鏈環肽抗生素桿菌肽（bacitracin），實現了NRPS 基因的外源表達。研究學者通過啟動子優化、宿主菌株篩選和重組表達成功構建了高效表達微球菌素MccJ25 和MccY 的枯草芽孢桿菌，且無抗生素耐藥標志物、無誘導劑、無孢子形成以及無內毒素負面作用，可用于抗菌治療和食品保存。

3.2 同源重組表達代謝酶

外源性酶是目前公認的一類飼料添加劑，常用于家禽和豬的飼料配方，能減少抗營養因子的負面影響，改善飼糧成分的消化和動物性能。同時酶還能被應用于解決畜牧業中抗生素使用增加、改善動物飼養環境等問題。

假單胞菌屬脂肪酶（Lipase）因具有其他微生物脂肪酶所沒有的生化特性而在脂肪酶應用領域備受青睞，在畜牧業中有良好使用前景。張飛燕等（2017 年）從具有脂肪酶活性的銅綠假單胞菌中克隆LipA 基因，構建整合表達質粒pHSG398-16S-lipA 后整合到枯草芽孢桿菌pab02染色體上，獲得了重組菌pab02-lipA，脂肪酶蛋白得到了有效表達[6]。

異丙二酮是一種潛在的致癌化合物和內分泌干擾物，在環境中難以降解。異丙二酮水解酶（IpaH）是一種高效的異丙二酮降解酶。研究學者成功構建了無標記的工程菌株WB800-ipaH，并通過染色體整合表達方法實現了ipaH 在枯草芽孢桿菌中的胞外表達，能有效清除土壤中的異丙二酮殘留，改善動物飼養環境。

3.3 同源重組表達有益代謝產物

利用同源重組技術，可以使枯草芽孢桿菌表達色素、氨基酸、維生素等多種有益代謝產物。這些產物不但可以作為飼料添加劑直接使用，還能夠改善畜牧環境，降低飼養成本，提高利用效率。

聚-γ-谷氨酸（γ-PGA）可作為飼料添加劑提高動物對微量元素的吸收，減少其排泄物對環境造成的污染，在畜牧業具有潛在應用價值。研究學者通過同源重組在ywtABC 基因上游區域引入了一段高效的合成表達控制序列，獲得了γ-PGA的枯草芽孢桿菌。

類胡蘿卜素具有生物活性和促進健康的特性，在飼料中具有良好應用前景。在飼料中補充類胡蘿卜素不僅可以提高家禽的生產性能、提高機體免疫力，還能夠增強雞蛋和肉的質量。Filluelo等（2023 年）[7]以質粒pJOE8999 為媒介，通過同源重組的方法將枯草芽孢桿菌BsMN3 的sigX 基因替換成fpps 基因。重組菌能夠內源產生C30 類胡蘿卜素，染色體整合crtMN 基因的過表達促進了C30 類胡蘿卜素的產生，FPPS 的過表達和分支途徑的減弱進一步提高了C30類胡蘿卜素的產量。

番茄紅素在畜牧養殖中常作為飼料添加劑發揮其著色和抗氧化功能，同時還具有改善肉品質、增加蛋黃營養和提高動物生長性能等功效。研究學者通過質粒pCas 將番茄紅素合成基因EBI 插入到枯草芽孢桿菌WB800N 的染色體上，成功構建了番茄紅素基因表達系統。

4 總結與展望

枯草芽孢桿菌作為益生菌的同時，其自然遺傳轉化系統可以通過同源重組將DNA 整合到基因組中，借此技術能夠表達多種在畜牧業有廣泛應用前景的活性蛋白（酶）和有益代謝產物。諸多影響因素尚未研究透徹，更加高效穩定的染色體整合體系建立仍有待進一步探索。目前枯草芽孢桿菌同源重組表達的外源基因多數是作為飼料添加劑來提高畜牧生產，更多地應用前景尚待研究。

未來的研究可以從以下幾點出發：①建立有效的多基因同時插入體系，進一步提高畜牧有益產物的表達。目前枯草芽孢桿菌的多位點整合系統依賴于反復的質粒構建來將基因依次插入到宿主菌染色體中，操作繁瑣且耗時；②解析影響染色體整合的因素或機制，尋找新的高效同源重組表達整合位點以建立促進整合效率的環境體系，提高外源基因的整合與表達效率；③從資源環境、疾病防控、質量安全和經濟效益等多方面探尋更多促進畜牧生產的外源基因，利用同源重組進行高效表達。預期隨著枯草芽孢桿菌基礎研究的進步，其同源重組表達外源基因將會在畜牧業生產中發揮更重要的作用。