應用噬菌體展示隨機12肽庫篩選諾如病毒抗原模擬表位

周飛園 王璐△ 梁芷妍 林璧慧 李佳恒 王宇 井多娜 張緒富 戴迎春

（1.南方醫科大學公共衛生學院流行病學系，廣州 510515；2.南方醫科大學中醫藥學院，廣州 510515）

諾如病毒（Norovirus，NoV）是導致非細菌性胃腸炎散發及暴發的主要病原體，約占全球急性胃腸炎發病率的1/5［1］。NoV屬于杯狀病毒科，是單股正鏈小RNA病毒，全長7.5～7.7 kb，由3個開放閱讀框（open reading frames，ORFs）組成，分別為ORF1、ORF2和ORF3，其中ORF2編碼主要衣殼蛋白（major capsid protein，VP1）。VP1包括衣殼區（shell domain，S）和突出區（protruding domain，P）［2］。其中P區可進一步分為相對保守的P1區和高度變異的P2區，前者能夠增強病毒顆粒穩定性，后者位于VP1最外層，具有高度變異性，含有抗原決定簇和潛在的中和抗原表位，存在與人類組織血型抗原（histoblooding group antigens，HBGAs）的結合位點，是構成免疫原性的關鍵區域［3-5］?？乖砦粵Q定了病毒的抗原特異性，能夠刺激人體產生抗體或淋巴細胞，對新型表位疫苗設計具有重要意義［6-7］。目前由于NoV的基因多樣性及高度變異性，且缺乏成熟的體外培養體系，嚴重阻礙了NoV疫苗發展［8］。因此，了解NoV的抗原表位及免疫原性對NoV疫苗發展有重要意義。

本研究利用課題組前期制備的全人源抗NoV中和性單鏈可變片段抗體（single-chain variable fragment antibody，scFv）［9］，應用噬菌體12肽庫技術淘選獲得NoV抗原模擬表位，并對抗原模擬表位進行初步鑒定，為后續NoV治療性單鏈抗體藥物和廣譜保護性疫苗研制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 Ph.D.-12噬菌體展示肽庫試劑盒購自美國NEB公司；M13噬菌體單鏈基因組DNA快速提取試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；HRP-羊抗鼠IgG購自美國Abcam公司；TMB辣根過氧化物酶底物顯色試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；源于GⅡ.6 NoV及GⅡ.17暴發感染者恢復期PBMC制備的NoV人源中和性scFv、GⅡ.4/GⅡ.6/GⅡ.17 NoV P蛋白、抗GⅡ.4/GⅡ.6/GⅡ.17小鼠血清及B型唾液由南方醫科大學流行病學實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體展示隨機十二肽庫淘選 選取課題組前期制備的源于GⅡ.6及GⅡ.17 NoV患者恢復期外周血的NoV人源中和性scFv［9］各6株，抗體來源見表1。噬菌體展示文庫篩選參照試劑盒說明書（E8110S）操作，以scFv與噬菌體展示文庫分別作用，進行三輪“吸附-洗滌-洗脫”生物淘選即可獲得與ScFv特異性結合的噬菌體。

表1 用于生物淘選NoV抗原模擬表位的scFv來源Tab.1 Source of scFv antibodies for biopanning of NoV antigen mimic epitopes

1.2.2 ELISA初步鑒定單克隆噬菌體 隨機挑取第3輪洗脫后的多個單克隆噬菌體進行擴增純化，鑒定噬菌體與scFv親和活性以及與NoV P蛋白的競爭作用。

1.2.2.1 Phage-ELISA鑒定噬菌體親和性 將scFv（2 μg/ml）包被于酶標板，4 ℃過夜后用5%脫脂奶粉封閉，以純化的噬菌體為一抗，陰性對照為淘選過程中洗滌下來未與scFv結合的噬菌體。加入anti-M13-HRP抗體（1∶3 000）作為二抗，TMB避光顯色，2 mol/L磷酸終止反應，讀取各孔OD450。若實驗孔OD450＞陰性孔OD4502倍，則判定為陽性噬菌體。實驗孔均設兩孔平行重復。

1.2.2.2 陽性噬菌體與P蛋白競爭作用鑒定 將scFv（2 μg/ml）包被于酶標板，4 ℃過夜后用5%脫脂奶粉封閉，加入陽性噬菌體50 μl和NoV P蛋白50 μl（GⅡ.6 P蛋白4 μg/ml，GⅡ.17 P蛋白0.4 μg/ml）混合液作為一抗，以anti-M13-HRP抗體（1∶3 500）為二抗，TMB避光顯色，2 mol/L磷酸終止反應，讀取各孔OD450。抑制率（%）=（陽性對照OD450-實驗組OD450）/陽性對照OD450×100%。實驗孔均設置兩孔重復。

1.2.3 陽性噬菌體DNA提取分析 參照M13噬菌體單鏈基因組DNA快速提取試劑盒說明書，提取陽性噬菌體DNA，送華大基因公司測序，以Ph.D.-12噬菌體展示肽庫試劑盒的-96gⅢ為測序引物。獲得的12肽序列用DNASTAR MegAlign程序與NoV VP1的氨基酸序同源性對比分析，選取出現次數較多且同源性高的多肽序列進行后續分析。

1.2.4 生物信息學分析 利用DNAstar軟件protean程序分析多肽抗原模擬表位在VP1中所在區域的β轉角、無規卷曲等二級結構情況，并分析其抗原性指數、親水性指數及表面可及性指數。使用蛋白結構預測SwissModell server（https：//swissmodel.expasy.org/）在線軟件，對GⅡ.4/GⅡ.6/GⅡ.17 NoV VP1進行同源建模獲得其三維結構，PyMol軟件分析抗原模擬表位在VP1中的定位。

1.2.5 ELISA檢測多肽與GⅡ.6 NoV P蛋白競爭抑制 多肽MGLDLWENFQVL（純度98%）由廣州睿博生物技術有限公司合成，分別包被與GⅡ.6 NoV P蛋白結合最優的唾液類型（B型；1∶1 000），4 ℃過夜后用5%脫脂奶粉封閉，加入梯度稀釋的多肽和GⅡ.6 NoV P蛋白混合液37 ℃孵育1 h。以鼠抗GⅡ.6血清（1∶3 500）為一抗，HRP-羊抗鼠IgG（1∶5 000）為二抗，TMB避光顯色后測定OD450。實驗孔均設置復孔，以無關多肽為陰性對照，計算多肽抑制率，公式同1.2.2.2。

2 結果

2.1 噬菌體隨機12肽庫淘選 經過3輪“吸附-洗滌-洗脫”生物淘選，產出率逐輪升高，說明有效富集了可與scFv特異性結合的噬菌體，淘選結果見表2。

表2 噬菌體隨機12肽庫對源于G Ⅱ.6 NoV暴發和GⅡ.17 NoV暴發的scFv淘選結果Tab.2 Panning results of phage display peptide library against scFv derived from a GⅡ.6 NoV outbreak and a G Ⅱ.17 NoV outbreak

2.2 單克隆噬菌體初步鑒定

2.2.1 Phage-ELISA鑒定噬菌體親和活性 包被與生物淘選過程中相應的scFv，以未與抗體結合的噬菌體為陰性對照，進行Phage-ELISA鑒定，陽性噬菌體與抗體的親和活性結果見圖1。

圖1 陽性噬菌體克隆與源于G Ⅱ.6 NoV、GⅡ.17 NoV暴發的scFv的結合活性分析Fig.1 Affinity analysis of positive phage clones with scFv derived from GⅡ.6 NoV and GⅡ.17 NoV outbreak

2.2.2 競爭抑制ELISA篩選NoV抗原模擬表位對陽性噬菌體進行競爭抑制ELISA試驗，發現GⅡ.6 NoV P蛋白能不同程度地抑制陽性噬菌體與scFv結合，抑制率為19.12%～89.61%（圖2A）。GⅡ.17 NoV P蛋白也能抑制陽性噬菌體與scFv結合，抑制率為10.70%～83.76%（圖2B）。

圖2 G Ⅱ.6 NoV、GⅡ.17 NoV P蛋白對陽性噬菌體克隆與scFv抗體結合的競爭抑制作用Fig.2 Competitive inhibition of GⅡ.6 NoV and GⅡ.17 NoV P proteins on binding of positive phage clones and scFv

2.3 陽性噬菌體克隆的DNA序列分析 將對NoV P蛋白有抑制作用的陽性噬菌體進行DNA提取并送測序分析，最終得到27條不同堿基序列并將其翻譯為氨基酸序列（表3、表4）。其中MGLDLWENFQVL和FHWPSYYLTPWV出現頻次較多，分別為47次和3次，提示其展示了scFv與NoV結合的高親和力高肽段。同源性對比這兩條肽段與NoV VP1蛋白有3段有高同源性的氨基酸序列（圖3、圖4）：MGXDXWWXXPXY和YXXXXXXXLXPXXWV（其中X代表任一氨基酸）。

圖3 G Ⅱ.6 NoV VP1區域與多肽MGLDLWENFQVL的高同源性片段Fig.3 High homology fragment between G Ⅱ.6 NoV VP1 region and MGLDLWENFQVL

圖4 GⅡ.4/GⅡ.6/G Ⅱ.17 NoV VP1區域與多肽FHWPSYYLTPWV的高同源性片段Fig.4 High homology fragment between GⅡ.4/GⅡ.6/G Ⅱ.17 NoV VP1 region and FHWPSYYLTPWV

圖5 GⅡ.4/GⅡ.6/G Ⅱ.17 NoV VP1中部分區域二級結構分析Fig.5 Secondary structure analysis of some regions in GⅡ.4/GⅡ.6/G Ⅱ.17 NoV VP1

圖6 “MG-D-W”“W-P-Y”“Y-L-P-WV”在G Ⅱ.6 NoV VP1三維結構的位置Fig.6 Location of "MG-D-W""W-P-Y""Y-L-P-WV" in 3D structure of G Ⅱ.6 VP1

表3 源于G Ⅱ.6 NoV暴發的scFv的陽性噬菌體克隆氨基酸序列Tab.3 Amino acid sequences of positive phage clones for scFv derived from G Ⅱ.6 NoV outbreak

表4 源于GⅡ.17 NoV暴發的scFv的陽性噬菌體克隆氨基酸序列Tab.4 Amino acid sequences of positive phage clones for scFv derived from GⅡ.17 NoV outbreak

2.4 生物學信息分析

2.4.1 多肽抗原模擬表位與VP1二級結構的關系 蛋白潛在的抗原表位具有親水性、柔韌性、抗原指數和表面可及性較高的特征且常位于轉角或無規則卷曲區域，其中抗原指數、親水性＞0及表面可及性＞1形成表位的可能性較大［10］。Protean分析發現，序列“MG-D-W”位于GⅡ.6 VP1蛋白402～407氨基酸區域，該區域中具有豐富的無規則卷曲結構且親水性＞0、抗原性＞0及表面可及性＞1，該序列為GⅡ.6抗原表位的可能性較大。而在GⅡ.4/GⅡ.6/GⅡ.17這三株NoV的VP1蛋白中序列“W-P-Y”和序列“Y-L-P-WV”所在區域分別有抗原性＜0、表面可及性＜1，抗原性＜0等情況（Protean分析結果通過VP1整條序列獲得的，圖4僅截取部分結果）。

2.4.2 多肽抗原模擬表位與VP1三維結構的關系 “MG-D-W”處于無規則卷曲結構，與Protean分析結果一致，這4個氨基酸間距離較近，并暴露于GⅡ.6 VP1蛋白P2區表面，而P2區是存在NoV與HBGA受體結合位點和主要抗原位點的主要區域［3］。此外，“MG-D-W”高度暴露且具有良好的嵌合結構，易被宿主免疫系統作為產生中和抗體的目標。“W-P-Y”和“Y-L-P-WV”分別位于VP1蛋白P2區域和P1區域，分別有色氨酸、酪氨酸暴露于VP1蛋白表面，其余氨基酸深埋于VP1蛋白，不利于抗體結合（綠色區域為VP1蛋白P1區，灰色為P2區，藍色為S區，“MG-D-W”“W-P-Y”及“Y-L-P-WV”分別以紅色、紫色、橙色顯示；“MG-D-W”僅出現于GⅡ.6VP1，而“W-P-Y”“Y-L-P-WV”在GⅡ.4和GⅡ.17 VP1三維結構的位置及二級結構均與GⅡ.6相同，因此僅展示GⅡ.6）。綜上，“MG-D-W”為抗原表位的可能性較大，且可能為GⅡ.6的特異性抗原表位。

2.5 多肽與P蛋白的競爭抑制ELISA 在合成多肽MGLDLWENFQVL與GⅡ.6 NoV P蛋白的競爭抑制ELISA實驗中，隨著多肽濃度逐漸升高，對P蛋白和HBGA的結合抑制作用逐漸增強（圖7）。

圖7 梯度稀釋多肽對GⅡ.6 NoV P蛋白與HBGA受體結合的競爭抑制作用Fig.7 Competitive inhibition of GⅡ.6 NoV P protein binding to HBGA receptors by gradient dilution peptides

3 討論

抗原表位又稱抗原決定簇，對其進行分析鑒定能夠為疫苗和抗病毒藥物研發提供重要信息［11］。傳統的抗原表位分析方法是通過人工合成一系列抗原蛋白肽段，再用ELISA、Western blot等方法鑒定這些肽段與相應抗體的結合能力，以此獲得抗原表位氨基酸序列、位置信息等。這種方法工作量大、費用高，且人工合成的蛋白肽段僅能模擬線性表位［12-13］。或用X射線衍射技術進行抗原表位研究，通過晶體學信息準確分析抗原表位的氨基酸構成及表位類型，該方法操作過程復雜，費用高，且僅在已知合適晶體情況下才能應用［14］。噬菌體展示技術是目前抗原表位篩選主流方法之一，是基于外源多肽或蛋白與噬菌體衣殼蛋白融合的一種技術，包被目的抗體后利用噬菌體隨機12肽庫進行生物淘選，即可獲得與目的抗體特異性結合的抗原表位［15-17］。噬菌體展示技術具有高親和選擇、高分辨率等優點，能夠識別抗NoV多克隆抗體及scFv中的多個不同抗原表位，有助于了解NoV表位分布［18］。具有中和作用的抗體是篩選和鑒定NoV抗原表位的重要工具，與傳統單克隆抗體相比，本研究所用的scFv體積較小，具有較高分辨率，能夠發現單克隆抗體未能識別的抗原表位［19］。

本研究利用Ph.D.-12噬菌體展示肽庫，以與GⅡ.4/GⅡ.6/GⅡ.17 NoV P蛋白具有高特異性且中和能力較強的scFv作為靶標蛋白進行生物淘選，獲得了與scFv特異性結合的噬菌體。以ELISA鑒定噬菌體，并對陽性噬菌體進行測序獲得其遞呈的十二肽序列，有2條出現頻次較多的序列MGLDLWENFQVL和FHWPSYYLTPWV。生物信息學分析結果提示“MG-D-W”為GⅡ.6抗原表位的可能性較大，可能模擬了GⅡ.6 NoV與scFv結合的抗原表位。通過合成多肽進一步驗證以排除噬菌體自身的影響，發現隨著多肽濃度升高其阻斷P蛋白與HBGA受體結合的能力增強。

GⅡ.6 NoV以散發為主，較少引起暴發流行［20］。2016-2018年，我國疫情監測數據顯示：GⅡ.6引起的NoV暴發共有16起（3.4%）［21］。同時，GⅡ.6在美國、巴西、阿根廷、日本等國引起了多起NoV胃腸炎暴發［22-25］，成為幼兒感染NoV的第二大常見毒株，提示GⅡ.6發病率在全球范圍內呈現一定上升趨勢。因此，有學者根據河北省正定縣50多年的腹瀉監測數據分析結果，提出GⅡ.6應納入NoV疫苗候選毒株［26］。但目前NoV候選疫苗主要集中于GⅠ.1、GⅠ.3、GⅡ.3、GⅡ.4和GⅡ.17 NoVs幾種基因型，尚無GⅡ.6疫苗研發，且關于GⅡ.6 NoV抗原表位的研究較少，QIU等［27］首次提出GⅡ.6 NoV與HBGA的結合區域位于286～312氨基酸殘基之間。因此本研究成功篩選并鑒定的GⅡ.6 NoV的抗原表位“MG-D-W”，能夠為NoV疫苗設計提供重要信息。