乙醇萃取對大豆分離蛋白風味影響研究

李曉敏，季國志，董 陽

（內蒙古蒙牛乳業（集團） 股份有限公司，內蒙古呼和浩特 011500）

近年來，隨著植物基產品的迅速發展，植物蛋白的開發和應用備受關注。大豆分離蛋白（Soybean protein isolate，SPI） 因蛋白質消化利用率高，富含人體必需氨基酸及獨特的功能特性[1]，成為食品加工重要的植物蛋白原料。由于其原料大豆在加工過程中產生較多揮發性風味物質[2-4]，極大地限制了大豆分離蛋白的廣泛應用。這些揮發性風味物質大致可分為非豆腥味物質和豆腥味物質。非豆腥味物質是大豆本身含有的具有愉悅氣味的風味成分，如苯甲醛等，但在一些植物基替代產品中應用時，這些風味也常常被去除或被掩蓋[5]。豆腥味物質主要是大豆分離蛋白在加工或貯藏過程脂肪氧化酶（Lip-oxygenase，LOX） 氧化不飽和脂肪酸或者由光敏自動氧化產生的[6]，多數為一些醛、酮和醇類化合物，如己醛、戊醛、1 - 辛烯- 3 - 醇、2 - 戊基呋喃、2,4 -癸二烯醛等，能使產品產生豆腥、油脂、青草等不良風味[2，7]。豆腥味的去除是食品行業比較關注和需重點解決的技術問題。目前，大豆分離蛋白工業生產多采用傳統的堿溶酸沉工藝，隨著大豆加工遷移帶入的特征風味仍比較明顯[8]。溶劑萃取法是通過攪拌、混合或離心將風味化合物從食品基質中轉移到有機溶劑中，以達到分離風味成分的目的[8]。乙醇是常用的有機溶劑，可以通過萃取除去大豆分離蛋白中的醛、醇類等化合物，改善產品風味[9]。采用乙醇處理大豆分離蛋白，通過頂空固相微萃取和氣相色譜- 質譜聯用（GC-MS） 技術分析萃取前后大豆分離蛋白中主要揮發性風味物質變化，并結合感官評價綜合分析采用乙醇處理大豆分離蛋白制備豆奶的風味改善情況，綜合探討乙醇萃取對大豆分離蛋白風味的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白，杜邦雙匯漯河食品有限公司提供；乙醇（≥95%），內蒙古利牛生物化工有限責任公司提供；椰子油，秦皇島金海特種食用油工業有限公司提供；白砂糖，中糧屯河崇左糖業有限公司提供；磷脂，嘉吉亞太食品系統（北京） 有限公司提供。

1.2 儀器與設備

CR21GII 型高速冷凍離心機，日本日立集團產品；STRIKE 280 型旋轉蒸發儀，德國Chemtron 公司產品；TQ8030 型氣質聯用儀，日本島津公司產品；57348-U 型固相微萃取頭，美國Supelco 公司產品；ME5002TE 型電子天平，美國梅特勒托利多有限公司產品；RET control-visc 型磁力攪拌器，德國IKA 公司產品；W20M-2 型恒溫水浴箱，美國SHELLAB 公司產品；L5M 型高剪切混合乳化器，英國Silverson公司產品；APV1000 型高壓均質機，德國APV 公司產品；PT-20T 型微型超高溫UHT 殺菌及充填系統，日本POWERPOINT 公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備（1） 大豆分離蛋白理化指標。蛋白質含量90%，具有特有原料風味。

（2） SPI 乙醇萃取處理。取一定量的SPI 與酒精（50%，W/W）溶液1∶4 進行混合；在攪拌狀態下25 ℃保持30 min；以轉速10 000 r/min 離心10 min，取沉淀；加水分散，以轉速6 000 r/min 高剪切處理10 min；真空度12 kPa，于75 ℃條件下蒸餾，待酒精蒸發完畢，得到蛋白濃縮物。將蛋白濃縮物配制成蛋白含量為10%的蛋白溶液備用。

（3） SPI 溶液。配制質量分數為10%的SPI 水溶液，40～50 ℃水合30 min，以轉速6 000 r/min 高剪切處理10 min，備用。

1.3.2 頂空固相微萃取和氣相色譜分析

取2.5 g蛋白溶液樣品和2.5 g水混合均勻于20 mL頂空瓶中，加入10 μg/mL 的乙酸正戊酯溶液50 μL作為內標，樣品在60 ℃恒溫下平衡10 min；插入萃取頭距離液面0.5～1.0 cm 處，萃取20 min，萃取頭老化溫度及時間：250 ℃，25 min。然后插入氣相色譜儀進行分析，分析條件為進樣口溫度250 ℃；柱流量0.8 mL/min；分流比5∶1；升溫程序：起始溫度50 ℃，以2 ℃/min 升至160 ℃，再以15 ℃/min 升至285 ℃保持15 min。離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；傳輸管線溫度285 ℃；電離電壓70 eV；掃描范圍29～450。

1.3.3 關鍵風味物質評價

為了更好地分析大豆分離蛋白中關鍵性風味物質對特征風味的貢獻大小，采用風味活性值（OAV）進行評價。OAV 是風味物質的質量濃度與其香氣閾值的比值，其值能更加科學地體現某種風味物質對樣品整體感官風味的貢獻程度，OAV 值越大，則貢獻越大[10-11]。

1.3.4 SPI 溶解性及其制備豆奶感官評價

（1） 溶解性評價。分別將大豆分離蛋白（SPI）和乙醇萃取后的大豆分離蛋白（ESPI） 配制蛋白含量3.2%的蛋白溶液，于50 ℃下攪拌溶解30 min，高速剪切10 min，冷卻至室溫，以轉速3 000 r/min離心10 min，測定溶液pH 值、粒徑、離心沉淀率，每組溶液測試3 個重復取平均值，評估乙醇處理對SPI 溶解特性影響。

（2） 感官評價。分別利用大豆分離蛋白（SPI）和乙醇萃取后的大豆分離蛋白（ESPI） 制備蛋白含量為3.2%的豆奶，具體操作步驟：將大豆分離蛋白溶于50 ℃水中，水合30 min，加入椰子油、白砂糖、磷脂攪拌溶解，采用高剪切混合乳化器乳化10 min，經20 MPa 均質后進行UHT 殺菌（溫度137 ℃，時間4 s），無菌灌裝后得到SPI 豆奶和ESPI 豆奶，用于感官評價。

感官分析采用Profiling 評估方法，由12 名專業感官人員對SPI 豆奶和ESPI 豆奶進行品嘗評分。豆奶評估指標包括特征風味、脂肪感、口中稠度、順滑度、后味。其中，特種風味進一步評估了乳香味、豆腥味、生谷物味、豆香味、油味、奶油味指標。評分標準采用10 點標度法：0～1 分為完全沒有，2～3 分為輕微，4～5 分為中等程度，6～7 分為強，8～9 分為極強。

2 結果與分析

2.1 大豆分離蛋白揮發性風味物質分析

乙醇萃取前后大豆分離蛋白中揮發性風味物質色譜圖見圖1，SPI 揮發性風味物質組成見表1。

表1 SPI 揮發性風味物質組成

圖1 乙醇萃取前后大豆分離蛋白中揮發性風味物質色譜圖

萃取前和萃取后SPI 分別鑒定出31 種、29 種揮發性風味物質，其中近50%的風味物質屬于醛類物質。萃取前和萃取后SPI 中的主要揮發性風味成分均為2 - 戊基呋喃、己醛、壬醛、苯甲醛、葵醛、反式- 2 - 辛烯醛等，但經乙醇萃取后SPI 中的揮發性風味物質含量（0.6 mg/L） 較萃取前（2.1 mg/L）明顯降低約71%。該結果與已有通過乙醇處理減弱蛋白風味研究結論相符，由于許多醛類、酮類等風味物質能溶于乙醇，通過萃取方式可以有效除去風味物質[9]。

2.2 大豆分離蛋白特征氣味成分分析

由于不同風味物質的風味閾值及風味特征不同，SPI 中檢測到的明顯高于其香氣閾值的風味物質。

SPI 中主要風味物質的香氣特征及OAV 值見表2，乙醇萃取前后SPI 中主要揮發性風味物質含量變化程度見圖2。

表2 SPI 中主要風味物質的香氣特征及OAV 值

圖2 乙醇萃取前后SPI中主要揮發性風味物質質量濃度變化程度

這些風味物質根據其香氣特征分為兩類：非豆腥味物質和豆腥味物質。SPI 中主要的非豆腥味物質包括苯甲醛、戊醛、辛醛、壬醛、葵醛、十一醛，其中苯甲醛呈現豆香味，雖然在SPI 中含量較高，但低于其香氣閾值（0.35～3.50 mg/L）[12]，且其OAV小于1，并不是貢獻SPI 非豆腥味的主要物質。葵醛、壬醛、辛醛、十一醛、戊醛均具有果香味特征，這些風味物質的含量均高于其香氣閾值，OAV 值大于1，是賦予SPI 非豆腥味的主要成分；在經乙醇萃取處理后，這些主要非豆腥味成分含量分別減少了45%，43%，59%，52%，94%（見圖2），尤其戊醛含量降低至其香氣閾值以下，OAV 值小于1，十一醛含量也降低至接近其香氣閾值，均不再是非豆腥味的主要成分；對乙醇處理后SPI 非豆腥味貢獻較大的成分則主要是葵醛、壬醛和辛醛。

SPI 中豆腥味物質主要包括（按照其風味貢獻由大到小依次排序） 2,4 - 癸二烯醛、2 - 戊基呋喃、反式- 2 - 壬烯醛、己醛、1 - 辛烯- 3 - 醇、反式-2 - 辛烯醛、反式- 2 - 庚烯醛，這些風味物質分別呈現油脂味、青草味、泥土味等，且氣味閾值較低，是引起SPI 不良風味的主要成分。2,4 - 癸二烯醛呈現深度油脂味，主要是由LOX1 催化13 - 氫過氧亞油酸產生[13]，在SPI 中雖然含量不高，但是其香氣閾值極低（0.007 μg/L），對SPI 異味產生的影響最大；經乙醇處理后，其含量明顯降低（約82%），但仍是影響SPI 風味的主要因素。2 - 戊基呋喃呈青草味、泥土味、豆味，是由大豆核黃素提供的單線態氧或光敏誘發亞油酸氧化產生[14]，是SPI 中的主要風味成分，也是引起豆腥味的主要物質，經乙醇萃取處理后，SPI 中2 - 戊基呋喃含量降低約78%，OAV 值由132.2 降低至29.3，對豆腥味的影響明顯減弱。此時，反式- 2 - 壬烯醛香氣閾值較低0.08 μg/L，是由亞油酸自動氧化形成的9 - 氫過氧化物分解產生，具有較好的熱穩定性，呈現油炸味[3]，乙醇萃取處理后，其含量未發生變化，說明該風味物質不能通過乙醇萃取方法除去。己醛呈現青草味，是很多大豆制品中引起豆腥味的主要風味物質，其是由LOX2通過催化亞油酸生成13 - 氫過氧亞油酸，再經乙醇脫氫酶分解形成的[7]；SPI 中乙醛含量較高，經乙醇萃取處理后，己醛含量明顯降低71%。1- 辛烯- 3- 醇在很多大豆制品研究中也被認為是引起不良風味的主要成分，呈現蘑菇味、泥土味，主要在大豆浸泡過程中產生，是大豆胚芽中的糖苷被β - 糖苷酶水解時從糖苷中解離出來的[15]，乙醇處理對1 - 辛烯-3 - 醇的去除效果較好，約93%的1 - 辛烯- 3 - 醇被除去，終含量（0.002 mg/L） 降低至接近香氣閾值（0.001 mg/L）。反式- 2 - 辛烯醛、反式- 2 - 庚烯醛分別呈現脂蠟味、青草味，反式- 2 - 辛烯醛是由LOX1 氧化亞麻酸形成的11- 氫過氧化物分解產生[16]，反式- 2- 庚烯醛主要是由大豆胚芽中的亞油酸經光敏或單線態氧化形成12- 氫過氧化物，在Fe2+作用下分解產生的，受鐵離子、pH 值、螯合劑影響較大[17]；經乙醇萃取處理后，其含量分別降低52%，57%，尤其是反式- 2 - 庚烯醛含量（0.014 mg/L） 接近其香氣閾值0.013 mg/L。綜合分析，除反式- 2 - 壬烯醛外，SPI 中的豆腥味物質的OAV 值在經乙醇萃取處理后均有明顯減小，說明乙醇處理能有效減弱SPI的豆腥味，尤其是1 - 辛烯- 3 - 醇和反式- 2 - 庚烯醛均被認為不再是引起SPI 不良風味的主要風味物質。已有研究表明，乙醇水平越高，風味物質的去除效率越高，一方面乙醇能使脂肪氧化酶活性降低，減少風味物質的產生；另一方面由于其極性較低，與風味物質具有更強的親和力[9]。

2.3 乙醇處理對SPI 溶解性的影響

經乙醇處理后的SPI，溶解后pH 值未發生變化，離心沉淀率和粒徑大小有所增加，但是不顯著（p＞0.05），說明乙醇處理對大豆分離蛋白溶解性有影響但不顯著，與已有研究結果相似[20]。SPI 原料在乙醇洗滌過程中，可能由于溶劑極性低會引起部分蛋白質變性，而在較高乙醇水平下，SPI 中的白蛋白和球蛋白含量的增加及脯氨酸的減少，反而會增加蛋白質的溶解性[9]。試驗采用的大豆分離蛋白原料蛋白質含量較高，且在相對高水平乙醇洗滌過程中大部分SPI 處于非溶解狀態，其分子結構受到乙醇影響較小，因此溶解性受到的影響也較小。

乙醇處理前后SPI 的理化特性見表3。

表3 乙醇處理前后SPI 的理化特性

2.4 豆奶感官評價

SPI 豆奶和ESPI 豆奶感官評分見圖3。

圖3 SPI 豆奶和ESPI 豆奶感官評分

由圖3 可知，對SPI 豆奶和ESPI 豆奶進行的綜合感官評分結果顯示，ESPI 豆奶在特征風味、后味、脂肪感、口中稠度上均比SPI 豆奶明顯降低，同時順滑度有所增加。在特征風味上，ESPI 豆奶的生谷物味、豆腥味、油味、豆香味均較SPI 豆奶顯著降低，特征風味得到明顯改善。與該試驗風味成分分析結果相符。感官評價進一步論證了乙醇處理能有效改善SPI 的風味品質。

3 結論

溶劑萃取法除去大豆分離蛋白的不良風味已有相關報道[9，20-22]，該方法工藝簡單、成本較低，工業化生產具有可實現性。基于大多數醛類、酮類等風味物質溶于乙醇的原理，通過乙醇洗滌改善SPI 風味的方法具有一定的前景。研究發現，乙醇萃取處理對非豆腥味物質和豆腥味物質都有不同程度的去除效果，尤其對豆腥味去除效果更顯著，可能與不同風味物質和蛋白質結合程度不同有關[23]。非豆腥味物質中戊醛含量降低最顯著，葵醛、辛醛、壬醛、十一醛的含量分別降低40%～60%。豆香、果香味等非豆腥味的降低有利于SPI 在食品領域應用范圍的擴大。豆腥味物質中對異味貢獻最大的風味物質是2,4 - 癸二烯醛，其次依次為2 - 戊基呋喃、己醛，1- 辛烯- 3- 醇、反式- 2- 辛烯醛、反式- 2- 庚烯醛。經乙醇萃取處理后，這些豆腥味物質的含量分別降低了82%，78%，70%，93%，52%，57%。由此可見，乙醇萃取對豆腥味物質均有較好的去除效果，尤其是1 - 辛烯- 3 - 醇除去效果最顯著，與已有研究結論相符[21]。經乙醇處理SPI 制備豆奶的豆腥味、豆香味、油味也明顯減弱，進一步證實了經乙醇處理SPI 風味得到明顯改善。很多研究表明，2,4- 癸二烯醛、1 - 辛烯- 3 - 醇、2 - 戊基呋喃、己醛是造成大豆制品青草味和豆腥味的主要物質，研究發現乙醇萃取對這些風味物質均有顯著的去除效果，論證了溶劑萃取方法應用于食品工業具有實際意義。