超聲聯(lián)合果膠酯酶優(yōu)化低酯山楂果膠提取工藝研究

李志偉，馬 勇，陳 洋，盤(pán)賽昆

（江蘇海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇連云港 222000）

果膠廣泛存在于植物的果實(shí)、根、莖、葉中，是細(xì)胞壁的一種組成成分，基本組成的部分為甲酯化半乳糖醛酸[1]。果膠按其甲酯化的大小可以分為高酯果膠（HMP） 和低酯果膠（LMP） 兩類(lèi)。HMP 一般是是甲酯化度高于50%，即甲氧基含量高于7%的果膠；LMP 是指甲酯化度介于25%～50%，即甲氧基含量低于7%的果膠[2]。果膠的用途很廣，70%的果膠用于食品添加劑行列，兩類(lèi)果膠的區(qū)別在于膠凝機(jī)理的不同[3]。HMP 受限于pH 值和共熔物的制約，只能用于高糖食品的生產(chǎn)。LMP 形成凝膠的條件不受限于pH 值和共熔物，只需要足夠的高價(jià)金屬離子就可以形成膠體。LMP 能夠出色地滿(mǎn)足人們對(duì)低糖、低鹽、低熱量食品的要求[4]。最近幾年來(lái)，世界上糖尿病患者呈上升趨勢(shì)，減肥成為一種時(shí)尚，商家針對(duì)這一特性開(kāi)發(fā)出了一系列低糖保健食品，在選擇用膠時(shí)，LMP 有著巨大的優(yōu)勢(shì)。

山楂作為我國(guó)特有原產(chǎn)果樹(shù)，內(nèi)含豐富果膠，在現(xiàn)有水果中果膠含量位居首位，是制備低酯果膠的優(yōu)秀原材料[5]。利用山楂中固有的果膠酯酶并采用超聲輔助提取低酯果膠，對(duì)提取的低酯果膠進(jìn)行基本成分測(cè)定。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

山楂，市售；乙醇，無(wú)錫源之泉化工產(chǎn)品有限公司提供；Na2CO3，安琪酵母股份有限公司提供。

1.2 主要設(shè)備

恒溫干燥箱，吳江富盛烘箱設(shè)備有限公司產(chǎn)品；超微粉碎機(jī)，濰坊新亞能粉體設(shè)備有限公司產(chǎn)品；電子天平，南北儀器有限公司產(chǎn)品；低速離心機(jī)，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；真空干燥箱，吳江市埃爾特電熱設(shè)備有限公司產(chǎn)品；超聲細(xì)胞破碎儀，南京先歐儀器制造有限公司產(chǎn)品；恒溫水浴鍋，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司產(chǎn)品。

1.3 工藝流程

1.4 操作要點(diǎn)

（1） 原料處理。山楂去核去蒂后，放入恒溫干燥箱中去除水分，將山楂置于超微粉碎機(jī)中粉碎。

（2） 脫酯。將原料中加入適量的水得到料液，再加入Na2CO3，利用超聲細(xì)胞破碎儀進(jìn)行脫酯工作。

（3） 熱水浸提。將料液放入水浴鍋中加熱攪拌3 h，用離心機(jī)以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心10 min，收集上清液。

（4） 濃縮。將上清液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至30%，去除上清液中的水分。

（5） 乙醇沉淀：將濃縮后的上清液中加入1.5 倍體積的95%乙醇溶液，沉淀出果膠。

（6） 成品果膠。將沉淀物放入真空干燥箱中烘干、粉碎后，即得果膠成品。

1.5 單因素試驗(yàn)

分別考查不同料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30（g∶mL） 對(duì)山楂果膠提取率的影響；不同激活劑質(zhì)量6%，10%，14%，18%，22%對(duì)山楂果膠提取率的影響；不同超聲時(shí)間30，60，90，120，150 min 對(duì)山楂果膠提取率的影響；不同超聲功率215，250，285，320，355 W 對(duì)山楂果膠提取率的影響。

1.6 響應(yīng)面試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為指標(biāo)，低酯山楂果膠提取率作為響應(yīng)值，將料液比、激活劑質(zhì)量、超聲時(shí)間、超聲強(qiáng)度作為影響因子，進(jìn)行四因素三水平試驗(yàn)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，利用Design Expert.12 進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析，優(yōu)化超聲波輔助內(nèi)源酶提取低酯果膠生產(chǎn)工藝[6]。

1.7 低酯果膠得率的測(cè)定

果膠得率按如下公式計(jì)算：

1.8 低酯果膠甲氧基含量的測(cè)定

用分析天平準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g 果膠粉末，將其完全溶解在100 mL 蒸餾水中，在果膠溶液中加入2～3 滴酚酞溶液，用濃度為0.1 mmol 的NaOH 滴定果膠溶液，使溶液滴定至紅色0.5 min 內(nèi)不褪色為終點(diǎn)。再加入濃度為0.5 mmoL 的NaOH 溶液5 mL，于25 ℃環(huán)境下皂化2.5 h。用濃度為0.1 mol/L 的H2SO4溶液滴定至果膠溶液紅色消褪為止[7]。計(jì)算公式如下：

式中：V1——皂化時(shí)加入的氫氧化鈉體積，mL；

C1——皂化時(shí)加入的氫氧化鈉濃度，mol/L；

V2——滴定皂化后剩余堿液的硫酸體積，mL；

C2——滴定皂化后剩余堿液的硫酸濃度，mol/L；

m——試樣質(zhì)量，g；0.031——甲氧基毫摩爾數(shù)。

1.9 低甲氧基果膠質(zhì)構(gòu)特性的測(cè)定

配制含有15%蔗糖、0.1%黃原膠、0.9%卡拉膠的混合液，然后加入提取的低甲氧基山楂果膠，80 ℃加熱攪拌至膠完全溶解，使果膠粉含量為0.1%，溶液冷卻后，再加入檸檬酸，攪拌均勻，使檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%。將調(diào)配好的料液85℃水浴保持15 min殺菌，密封，4 ℃下冷藏靜置18 h 即成凝膠。同時(shí)，制備未添加果膠的凝膠和加入等量商品柑橘果膠的凝膠樣品，進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)。

1.10 理化指標(biāo)檢測(cè)

采用苯酚- 硫酸法測(cè)定山楂果膠的總糖含量[8]；采用福林酚比色法測(cè)定山楂果膠的多酚含量[9]；采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定山楂果膠的蛋白質(zhì)含量[10]；采用皂化滴定度法測(cè)定果膠的酯化度[11]；采用化學(xué)滴定度法測(cè)定果膠的酰胺化度[12]；參照國(guó)標(biāo)GB 5009.3—2016直接干燥法測(cè)定果膠的水分含量。

1.11 果膠酯酶的活力檢測(cè)

用pH-stat 法進(jìn)行檢測(cè)。用天平稱(chēng)取5 g 山楂粉放入100 mL 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的NaCl 溶液中，于2 ℃環(huán)境溫度下以轉(zhuǎn)速8 000 r/min 離心20 min，取上清液作為粗酶液。稱(chēng)取0.5 g 山楂果膠溶于100 g 蒸餾水中形成山楂果膠溶液，將溶液置于45 ℃環(huán)境溫度下恒溫并調(diào)pH 值至7.5，加入2 mL 粗酶液后開(kāi)始計(jì)時(shí)，用濃度為0.01 mol/L的NaOH 溶液將pH 值穩(wěn)定在7.5[14]。

1.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)取平均值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示（n=3），采用Origin pro 18.0，Excel 和Design Expert.12 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 山楂中果膠酯酶的活力

果膠酯酶作用時(shí)間與消耗NaOH 的關(guān)系見(jiàn)表1，PE 的作用曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。

圖1 PE 的作用曲線(xiàn)

表1 果膠酯酶作用時(shí)間與消耗NaOH 的關(guān)系

根據(jù)回歸方程Y=14.766X-17.78 可知，斜率為14.766，由此可以得到山楂中的果膠酯酶活力為14.766 μmol/s，根據(jù)酶的活力發(fā)現(xiàn)可利用果膠酯酶對(duì)山楂中的果膠進(jìn)行脫酯，制備低酯山楂果膠。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 果膠酯酶激活劑對(duì)低酯果膠提取率的影響

果膠酯酶激活劑對(duì)低酯果膠提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 果膠酯酶激活劑對(duì)低酯果膠提取率的影響

由圖2 可知，激活劑添加量為6%～10%時(shí)，果膠提取率迅速上升，提取率最高達(dá)到29.72%。激活劑濃度較低時(shí)，隨著添加量的增加，使得果膠酯酶的活性增強(qiáng)，脫酯反應(yīng)速率加快，甲氧基含量迅速降低；但隨著激活劑添加量達(dá)到一定程度，山楂中的果膠酯酶活性被消耗殆盡，過(guò)多的激活劑使得斷開(kāi)的甲酯鍵和糖苷鍵重新鏈接，使得酯化度上升[15]。綜合考慮，激活劑添加量選擇10%為佳。

2.2.2 料液比對(duì)低酯果膠提取率的影響

料液比對(duì)低酯果膠提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 料液比對(duì)低酯果膠提取率的影響

由圖3 可知，料液比為1∶10 ～1∶25 時(shí)，低酯果膠的提取率隨著料液比的增大而增加，在1∶25時(shí)果膠提取率達(dá)到24.63%。當(dāng)料液比為1∶25 ～1∶30 時(shí)，果膠提取率隨著料液比的增大開(kāi)始降低。當(dāng)料液比為1∶10 ～1∶25 時(shí)，隨著水的占比增加，使得原料內(nèi)外壓強(qiáng)產(chǎn)生差距，能夠讓果膠物質(zhì)從原料中較完全析出，提高果膠的提取率，但隨著水的比例過(guò)于增加，原料內(nèi)外的壓強(qiáng)差距過(guò)大，原料中的果膠物質(zhì)無(wú)法從原料中析出，果膠提取率開(kāi)始下降[16]。所以，料液比以1∶25 為佳。

2.2.3 超聲時(shí)間對(duì)低酯果膠提取率的影響

超聲時(shí)間對(duì)低酯果膠提取率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)低酯果膠提取率的影響

由圖4 可知，超聲時(shí)間的長(zhǎng)短會(huì)使原料具有不同的果膠提取率。當(dāng)超聲時(shí)間為120 min 時(shí)原料的低酯果膠提取率達(dá)到峰值28.5%，超聲波的產(chǎn)能和剪切力的作用使得熱量被聚集起來(lái)，給了果膠物質(zhì)良好的析出環(huán)境，但隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，會(huì)使得溫度過(guò)高，開(kāi)始破壞果膠的物質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而使果膠提取率降低[17]。因此，超聲時(shí)間選擇120 min 較好。

2.2.4 超聲功率對(duì)低酯果膠提取率的影響

超聲功率對(duì)低酯果膠提取率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 超聲功率對(duì)低酯果膠提取率的影響

由圖5 可知，超聲功率的不同會(huì)導(dǎo)致不同的果膠提取率。當(dāng)超聲功率為285 W 時(shí)，低酯果膠的提取率達(dá)到了37.3%，隨著超聲功率的增強(qiáng)，使得果膠中的部分水溶性果膠溶解，同時(shí)因?yàn)楣z酯酶的影響，過(guò)強(qiáng)的超聲功率會(huì)導(dǎo)致果膠中的結(jié)構(gòu)斷裂，降低果膠提取率。因此，超聲功率選擇285 W 為佳。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.3.1 模型建立及顯著性檢驗(yàn)

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2，回歸統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 回歸統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

由表3 可知，該回歸模型顯著（p＜0.05），所有二次項(xiàng)的p均小于0.05，表明所選因素對(duì)果膠提取率均有顯著影響。模型失擬項(xiàng)不存在顯著面（p＞0.05），表明實(shí)際值與預(yù)估值之間相差較遠(yuǎn)，表明方程擬合性好，試驗(yàn)誤差小。依據(jù)各因素顯著水平與F值大小進(jìn)行分析，各因素對(duì)果膠提取率影響從高到低為超聲時(shí)間（C） ＞激活劑添加量（A） ＞料液比（B） ＞超聲功率（D），并且所有試驗(yàn)果膠甲氧基含量均小于7%。

以激活劑添加量（A）、料液比（B）、超聲時(shí)間（C）、超聲功率（D） 為自變量，山楂低酯果膠提取率為因變量，對(duì)各組合處理得到山楂粗果膠提取率進(jìn)行二次回歸分析[18]，建立多元二次響應(yīng)面回歸模型：

2.3.2 響應(yīng)面分析

各因素響應(yīng)曲面和等高線(xiàn)見(jiàn)圖6。

圖6 各因素響應(yīng)曲面和等高線(xiàn)

響應(yīng)面圖能夠直觀(guān)地反映出各個(gè)單因素對(duì)響應(yīng)值的作用，也能夠看出各個(gè)因素相互之間的影響效果。圖6（a） ～6（d） 的等高線(xiàn)更接近橢圓形說(shuō)明因素B和C的交互作用對(duì)果膠提取率的影響顯著；圖6（e） 和6（f） 的等高線(xiàn)圖更接近圓形，說(shuō)明兩因素間的交互作用不明顯，交互作用分析結(jié)果與方差分析表中的結(jié)果相一致。

2.3.3 最佳工藝條件的預(yù)測(cè)與模型驗(yàn)證

由單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，最優(yōu)加工工藝條件為激活劑添加量12.28%，料液比1∶26（g∶mL），超聲時(shí)間119 min，超聲功率288 W，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果為26.79%，對(duì)此結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)低酯果膠提取率為（25.84±0.12） % ，理論值與實(shí)際值無(wú)顯著性差異，證明了該試驗(yàn)結(jié)果的可行性。

2.4 果膠甲氧基含量的測(cè)定

低酯果膠甲氧基含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 低酯果膠甲氧基含量測(cè)定結(jié)果

由圖7 可知，對(duì)單因素試驗(yàn)提取的果膠進(jìn)行甲氧基含量的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示提取出的果膠甲氧基含量均在7%以下，屬于低甲氧基果膠，即低酯果膠。

2.5 果膠質(zhì)構(gòu)特性的測(cè)定

低酯山楂果膠的凝膠質(zhì)構(gòu)特性見(jiàn)表4。

表4 低酯山楂果膠的凝膠質(zhì)構(gòu)特性

由表4 可知，與未添加果膠的凝膠樣品進(jìn)行對(duì)比，添加山楂果膠與低酯山楂果膠后，凝膠樣品的質(zhì)構(gòu)特性均有明顯提高，其中添加低酯山楂果膠樣品的硬度、彈性和黏聚性略大于添加山楂果膠的樣品。表明提取的低酯山楂果膠與市售的山楂果膠無(wú)顯著性差異，能夠達(dá)到商品果膠的使用效果。

2.6 理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果分析

山楂低酯果膠理化指標(biāo)見(jiàn)表5。

表5 山楂低酯果膠理化指標(biāo)

由表5 可知，由最優(yōu)工藝制作出的山楂果膠均符合干燥減量、二氧化硫、酸不溶灰分、總半乳糖醛酸、酰胺化度和重金屬鉛的含量等均符合GB 25533—2010 的要求。

3 結(jié)論

利用超聲波輔助果膠酯酶進(jìn)行提取低酯山楂果膠的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)最佳方案為激活劑添加量12.28%，料液比1∶26（g∶mL），超聲時(shí)間199 min，超聲功率288 W，果膠提取率為（25.84±0.12） %，并對(duì)果膠的理化指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 25533—2010 的相關(guān)要求。質(zhì)構(gòu)檢測(cè)結(jié)果顯示，添加低酯山楂果膠能夠有效提升凝膠樣品的質(zhì)構(gòu)特性且可達(dá)到商品果膠的使用效果。因此，可利用山楂來(lái)進(jìn)行低酯果膠的制備，擴(kuò)充低酯果膠的原料選擇。