超聲聯合果膠酯酶優化低酯山楂果膠提取工藝研究

李志偉，馬 勇，陳 洋，盤賽昆

（江蘇海洋大學食品科學與工程學院，江蘇連云港 222000）

果膠廣泛存在于植物的果實、根、莖、葉中，是細胞壁的一種組成成分，基本組成的部分為甲酯化半乳糖醛酸[1]。果膠按其甲酯化的大小可以分為高酯果膠（HMP） 和低酯果膠（LMP） 兩類。HMP 一般是是甲酯化度高于50%，即甲氧基含量高于7%的果膠；LMP 是指甲酯化度介于25%～50%，即甲氧基含量低于7%的果膠[2]。果膠的用途很廣，70%的果膠用于食品添加劑行列，兩類果膠的區別在于膠凝機理的不同[3]。HMP 受限于pH 值和共熔物的制約，只能用于高糖食品的生產。LMP 形成凝膠的條件不受限于pH 值和共熔物，只需要足夠的高價金屬離子就可以形成膠體。LMP 能夠出色地滿足人們對低糖、低鹽、低熱量食品的要求[4]。最近幾年來，世界上糖尿病患者呈上升趨勢，減肥成為一種時尚，商家針對這一特性開發出了一系列低糖保健食品，在選擇用膠時，LMP 有著巨大的優勢。

山楂作為我國特有原產果樹，內含豐富果膠，在現有水果中果膠含量位居首位，是制備低酯果膠的優秀原材料[5]。利用山楂中固有的果膠酯酶并采用超聲輔助提取低酯果膠，對提取的低酯果膠進行基本成分測定。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

山楂，市售；乙醇，無錫源之泉化工產品有限公司提供；Na2CO3，安琪酵母股份有限公司提供。

1.2 主要設備

恒溫干燥箱，吳江富盛烘箱設備有限公司產品；超微粉碎機，濰坊新亞能粉體設備有限公司產品；電子天平，南北儀器有限公司產品；低速離心機，湖南凱達科學儀器有限公司產品；真空干燥箱，吳江市埃爾特電熱設備有限公司產品；超聲細胞破碎儀，南京先歐儀器制造有限公司產品；恒溫水浴鍋，鄭州長城科工貿有限公司產品。

1.3 工藝流程

1.4 操作要點

（1） 原料處理。山楂去核去蒂后，放入恒溫干燥箱中去除水分，將山楂置于超微粉碎機中粉碎。

（2） 脫酯。將原料中加入適量的水得到料液，再加入Na2CO3，利用超聲細胞破碎儀進行脫酯工作。

（3） 熱水浸提。將料液放入水浴鍋中加熱攪拌3 h，用離心機以轉速4 000 r/min 離心10 min，收集上清液。

（4） 濃縮。將上清液置于旋轉蒸發儀中濃縮至30%，去除上清液中的水分。

（5） 乙醇沉淀：將濃縮后的上清液中加入1.5 倍體積的95%乙醇溶液，沉淀出果膠。

（6） 成品果膠。將沉淀物放入真空干燥箱中烘干、粉碎后，即得果膠成品。

1.5 單因素試驗

分別考查不同料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30（g∶mL） 對山楂果膠提取率的影響；不同激活劑質量6%，10%，14%，18%，22%對山楂果膠提取率的影響；不同超聲時間30，60，90，120，150 min 對山楂果膠提取率的影響；不同超聲功率215，250，285，320，355 W 對山楂果膠提取率的影響。

1.6 響應面試驗

以單因素試驗結果為指標，低酯山楂果膠提取率作為響應值，將料液比、激活劑質量、超聲時間、超聲強度作為影響因子，進行四因素三水平試驗，并對結果進行驗證，利用Design Expert.12 進行試驗設計與分析，優化超聲波輔助內源酶提取低酯果膠生產工藝[6]。

1.7 低酯果膠得率的測定

果膠得率按如下公式計算：

1.8 低酯果膠甲氧基含量的測定

用分析天平準確稱取1.0 g 果膠粉末，將其完全溶解在100 mL 蒸餾水中，在果膠溶液中加入2～3 滴酚酞溶液，用濃度為0.1 mmol 的NaOH 滴定果膠溶液，使溶液滴定至紅色0.5 min 內不褪色為終點。再加入濃度為0.5 mmoL 的NaOH 溶液5 mL，于25 ℃環境下皂化2.5 h。用濃度為0.1 mol/L 的H2SO4溶液滴定至果膠溶液紅色消褪為止[7]。計算公式如下：

式中：V1——皂化時加入的氫氧化鈉體積，mL；

C1——皂化時加入的氫氧化鈉濃度，mol/L；

V2——滴定皂化后剩余堿液的硫酸體積，mL；

C2——滴定皂化后剩余堿液的硫酸濃度，mol/L；

m——試樣質量，g；0.031——甲氧基毫摩爾數。

1.9 低甲氧基果膠質構特性的測定

配制含有15%蔗糖、0.1%黃原膠、0.9%卡拉膠的混合液，然后加入提取的低甲氧基山楂果膠，80 ℃加熱攪拌至膠完全溶解，使果膠粉含量為0.1%，溶液冷卻后，再加入檸檬酸，攪拌均勻，使檸檬酸質量分數為0.1%。將調配好的料液85℃水浴保持15 min殺菌，密封，4 ℃下冷藏靜置18 h 即成凝膠。同時，制備未添加果膠的凝膠和加入等量商品柑橘果膠的凝膠樣品，進行對照試驗。

1.10 理化指標檢測

采用苯酚- 硫酸法測定山楂果膠的總糖含量[8]；采用福林酚比色法測定山楂果膠的多酚含量[9]；采用考馬斯亮藍法測定山楂果膠的蛋白質含量[10]；采用皂化滴定度法測定果膠的酯化度[11]；采用化學滴定度法測定果膠的酰胺化度[12]；參照國標GB 5009.3—2016直接干燥法測定果膠的水分含量。

1.11 果膠酯酶的活力檢測

用pH-stat 法進行檢測。用天平稱取5 g 山楂粉放入100 mL 的質量分數為6%的NaCl 溶液中，于2 ℃環境溫度下以轉速8 000 r/min 離心20 min，取上清液作為粗酶液。稱取0.5 g 山楂果膠溶于100 g 蒸餾水中形成山楂果膠溶液，將溶液置于45 ℃環境溫度下恒溫并調pH 值至7.5，加入2 mL 粗酶液后開始計時，用濃度為0.01 mol/L的NaOH 溶液將pH 值穩定在7.5[14]。

1.12 數據統計分析

所有試驗進行3 次平行試驗取平均值進行數據分析，以“平均值±標準偏差”表示（n=3），采用Origin pro 18.0，Excel 和Design Expert.12 軟件對試驗數據進行處理和分析。

2 結果與分析

2.1 山楂中果膠酯酶的活力

果膠酯酶作用時間與消耗NaOH 的關系見表1，PE 的作用曲線見圖1。

圖1 PE 的作用曲線

表1 果膠酯酶作用時間與消耗NaOH 的關系

根據回歸方程Y=14.766X-17.78 可知，斜率為14.766，由此可以得到山楂中的果膠酯酶活力為14.766 μmol/s，根據酶的活力發現可利用果膠酯酶對山楂中的果膠進行脫酯，制備低酯山楂果膠。

2.2 單因素試驗結果分析

2.2.1 果膠酯酶激活劑對低酯果膠提取率的影響

果膠酯酶激活劑對低酯果膠提取率的影響見圖2。

圖2 果膠酯酶激活劑對低酯果膠提取率的影響

由圖2 可知，激活劑添加量為6%～10%時，果膠提取率迅速上升，提取率最高達到29.72%。激活劑濃度較低時，隨著添加量的增加，使得果膠酯酶的活性增強，脫酯反應速率加快，甲氧基含量迅速降低；但隨著激活劑添加量達到一定程度，山楂中的果膠酯酶活性被消耗殆盡，過多的激活劑使得斷開的甲酯鍵和糖苷鍵重新鏈接，使得酯化度上升[15]。綜合考慮，激活劑添加量選擇10%為佳。

2.2.2 料液比對低酯果膠提取率的影響

料液比對低酯果膠提取率的影響見圖3。

圖3 料液比對低酯果膠提取率的影響

由圖3 可知，料液比為1∶10 ～1∶25 時，低酯果膠的提取率隨著料液比的增大而增加，在1∶25時果膠提取率達到24.63%。當料液比為1∶25 ～1∶30 時，果膠提取率隨著料液比的增大開始降低。當料液比為1∶10 ～1∶25 時，隨著水的占比增加，使得原料內外壓強產生差距，能夠讓果膠物質從原料中較完全析出，提高果膠的提取率，但隨著水的比例過于增加，原料內外的壓強差距過大，原料中的果膠物質無法從原料中析出，果膠提取率開始下降[16]。所以，料液比以1∶25 為佳。

2.2.3 超聲時間對低酯果膠提取率的影響

超聲時間對低酯果膠提取率的影響見圖4。

圖4 超聲時間對低酯果膠提取率的影響

由圖4 可知，超聲時間的長短會使原料具有不同的果膠提取率。當超聲時間為120 min 時原料的低酯果膠提取率達到峰值28.5%，超聲波的產能和剪切力的作用使得熱量被聚集起來，給了果膠物質良好的析出環境，但隨著超聲時間的延長，會使得溫度過高，開始破壞果膠的物質結構，從而使果膠提取率降低[17]。因此，超聲時間選擇120 min 較好。

2.2.4 超聲功率對低酯果膠提取率的影響

超聲功率對低酯果膠提取率的影響見圖5。

圖5 超聲功率對低酯果膠提取率的影響

由圖5 可知，超聲功率的不同會導致不同的果膠提取率。當超聲功率為285 W 時，低酯果膠的提取率達到了37.3%，隨著超聲功率的增強，使得果膠中的部分水溶性果膠溶解，同時因為果膠酯酶的影響，過強的超聲功率會導致果膠中的結構斷裂，降低果膠提取率。因此，超聲功率選擇285 W 為佳。

2.3 響應面試驗結果分析

2.3.1 模型建立及顯著性檢驗

響應面試驗設計與結果見表2，回歸統計分析結果見表3。

表2 響應面試驗設計與結果

表3 回歸統計分析結果

由表3 可知，該回歸模型顯著（p＜0.05），所有二次項的p均小于0.05，表明所選因素對果膠提取率均有顯著影響。模型失擬項不存在顯著面（p＞0.05），表明實際值與預估值之間相差較遠，表明方程擬合性好，試驗誤差小。依據各因素顯著水平與F值大小進行分析，各因素對果膠提取率影響從高到低為超聲時間（C） ＞激活劑添加量（A） ＞料液比（B） ＞超聲功率（D），并且所有試驗果膠甲氧基含量均小于7%。

以激活劑添加量（A）、料液比（B）、超聲時間（C）、超聲功率（D） 為自變量，山楂低酯果膠提取率為因變量，對各組合處理得到山楂粗果膠提取率進行二次回歸分析[18]，建立多元二次響應面回歸模型：

2.3.2 響應面分析

各因素響應曲面和等高線見圖6。

圖6 各因素響應曲面和等高線

響應面圖能夠直觀地反映出各個單因素對響應值的作用，也能夠看出各個因素相互之間的影響效果。圖6（a） ～6（d） 的等高線更接近橢圓形說明因素B和C的交互作用對果膠提取率的影響顯著；圖6（e） 和6（f） 的等高線圖更接近圓形，說明兩因素間的交互作用不明顯，交互作用分析結果與方差分析表中的結果相一致。

2.3.3 最佳工藝條件的預測與模型驗證

由單因素試驗和響應面試驗可以發現，最優加工工藝條件為激活劑添加量12.28%，料液比1∶26（g∶mL），超聲時間119 min，超聲功率288 W，響應面試驗結果為26.79%，對此結果進行驗證，發現低酯果膠提取率為（25.84±0.12） % ，理論值與實際值無顯著性差異，證明了該試驗結果的可行性。

2.4 果膠甲氧基含量的測定

低酯果膠甲氧基含量測定結果見圖7。

圖7 低酯果膠甲氧基含量測定結果

由圖7 可知，對單因素試驗提取的果膠進行甲氧基含量的檢測，檢測結果顯示提取出的果膠甲氧基含量均在7%以下，屬于低甲氧基果膠，即低酯果膠。

2.5 果膠質構特性的測定

低酯山楂果膠的凝膠質構特性見表4。

表4 低酯山楂果膠的凝膠質構特性

由表4 可知，與未添加果膠的凝膠樣品進行對比，添加山楂果膠與低酯山楂果膠后，凝膠樣品的質構特性均有明顯提高，其中添加低酯山楂果膠樣品的硬度、彈性和黏聚性略大于添加山楂果膠的樣品。表明提取的低酯山楂果膠與市售的山楂果膠無顯著性差異，能夠達到商品果膠的使用效果。

2.6 理化指標檢測結果分析

山楂低酯果膠理化指標見表5。

表5 山楂低酯果膠理化指標

由表5 可知，由最優工藝制作出的山楂果膠均符合干燥減量、二氧化硫、酸不溶灰分、總半乳糖醛酸、酰胺化度和重金屬鉛的含量等均符合GB 25533—2010 的要求。

3 結論

利用超聲波輔助果膠酯酶進行提取低酯山楂果膠的優化，發現最佳方案為激活劑添加量12.28%，料液比1∶26（g∶mL），超聲時間199 min，超聲功率288 W，果膠提取率為（25.84±0.12） %，并對果膠的理化指標進行檢測均符合國家標準GB 25533—2010 的相關要求。質構檢測結果顯示，添加低酯山楂果膠能夠有效提升凝膠樣品的質構特性且可達到商品果膠的使用效果。因此，可利用山楂來進行低酯果膠的制備，擴充低酯果膠的原料選擇。