高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物源性食品中馬波沙星的殘留

陳 靈，欒慶祥，黃 鑫，金曉峰，趙 貴

（貴州省獸藥飼料檢測(cè)所，貴州貴陽 550003）

0 引言

馬波沙星（Marbofloxacin，MBF） 屬于氟喹諾酮類抗菌藥物，通過抑制細(xì)菌DNA 回旋酶活性，阻止其DNA 的合成復(fù)制，進(jìn)而發(fā)揮抗菌作用，對(duì)革蘭陰性菌、革蘭陽性菌和支原體表現(xiàn)出良好的抗菌效果[1-3]。馬波沙星給藥后吸收迅速完全，體內(nèi)分布廣泛，生物利用度高，作用于體內(nèi)多個(gè)組織[4-7]；常用于牛的呼吸道感染和急性乳房炎，豬的無乳綜合癥，以及犬貓的感染性疾病[8-13]。

目前，針對(duì)馬波沙星的檢測(cè)方法主要涉及酶聯(lián)免疫法[14-15]、膠體金免疫層析[16]、表面增強(qiáng)拉曼光譜（Surface Enhanced Raman Scattering，SERS）[17]、熒光探針法[18]、液相色譜法[19-21]、高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法[22-23]。其中，液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)等特點(diǎn)，對(duì)馬波沙星的殘留分析具有較大的優(yōu)勢(shì)。在馬波沙星的已有檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[24-25]中，也使用了液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法，但方法的前處理過程較為繁瑣，各方法能檢測(cè)的樣品種類少，不能較好地滿足多種類樣品的快速準(zhǔn)確檢測(cè)。鑒于馬波沙星常被應(yīng)用于多種動(dòng)物的疾病治療，在動(dòng)物體內(nèi)分布于多個(gè)靶組織中，需要一種能涵蓋多種動(dòng)物組織的檢測(cè)方法。因此，建立了一種簡便快捷、高效靈敏且能滿足多種動(dòng)物組織中馬波沙星檢測(cè)的HPLC-MS/MS 方法，為保證動(dòng)物性食品的質(zhì)量安全和馬波沙星的后續(xù)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)研究提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

（1） 儀器。AB Sciex Triple 6500+三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀，上海SCIEX 分析儀器貿(mào)易有限公司產(chǎn)品；全自動(dòng)智能氮吹儀、多樣品旋渦混合器，廣州得泰公司產(chǎn)品；ACQUITY HSS T3 型色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），美國沃特世公司產(chǎn)品；3K15 型高速冷凍離心機(jī)，德國Sigma 公司產(chǎn)品；KQ-500 DE產(chǎn)品數(shù)控超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；0.22 μm wwPTFE 微孔濾膜，美國PALL 公司產(chǎn)品；Milli-Q Direct-Q10 產(chǎn)品超純水機(jī)，美國默克密理博公司產(chǎn)品。

（2） 試劑。乙腈（色譜級(jí)），美國默克公司提供；甲醇（質(zhì)譜級(jí)），美國Fisher 公司提供；甲酸（質(zhì)譜級(jí)），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司提供；乙酸（分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；正己烷（分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；試驗(yàn)用超純水為Milli-Q Direct-Q10 超純水機(jī)制備。

馬波沙星-D8標(biāo)準(zhǔn)品（純度96%），加拿大Toronto Research Chemicals 公司提供；馬波沙星標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.8%），中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

試驗(yàn)用的牛肉、牛肝、牛腎、牛脂肪、牛奶、豬肉、豬肝、豬腎、豬脂肪等9 種樣品，均購自當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

（1） 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確稱取馬波沙星標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用乙腈溶解并稀釋至10 mL 容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的馬波沙星標(biāo)準(zhǔn)貯備液，0 ℃以下避光保存；準(zhǔn)確稱取馬波沙星-D8標(biāo)準(zhǔn)品0.5 mg，用乙腈溶解并稀釋至10 mL 容量瓶中，得50 μg/mL 馬波沙星-D8標(biāo)準(zhǔn)貯備液，0 ℃以下避光保存。

（2） 標(biāo)準(zhǔn)中間液。準(zhǔn)確量取馬波沙星標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.1 mL，于100 mL 容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，配制成質(zhì)量濃度為1 μg/mL 的馬波沙星標(biāo)準(zhǔn)中間液；準(zhǔn)確量取馬波沙星-D8標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.1 mL，于5 mL 容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，配制成質(zhì)量濃度為1 μg/mL 的馬波沙星-D8標(biāo)準(zhǔn)中間液。

（3） 標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液。準(zhǔn)確量取馬波沙星中間液和馬波沙星-D8標(biāo)準(zhǔn)中間液適量，用0.1%甲酸水+甲醇（9+1） 配制成馬波沙星質(zhì)量濃度為5，20，50，100，200，400 μg/L，馬波沙星-D8質(zhì)量濃度均為10 μg/L 的馬波沙星系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 樣品的前處理

牛肉、牛肝、牛腎、牛脂肪、豬肉、豬肝、豬腎和豬脂肪均搗碎均質(zhì)后使用，牛奶直接使用。

（1） 樣品提取。稱取試料2 g（準(zhǔn)確至0.02 g），置于50 mL 離心管中，加入1 μg/mL 的馬波沙星-D8標(biāo)準(zhǔn)中間液20 μL，加入8 mL 的1%乙酸乙腈溶液，渦旋0.5 min，超聲振蕩10 min，于低溫5 ℃下以轉(zhuǎn)速10 000 r/min 離心5 min，取上清液轉(zhuǎn)入到另一10 mL 離心管中，于50 ℃下氮?dú)獯蹈桑瑴?zhǔn)確加入2 mL 的0.1%甲酸水+甲醇（9+1） 復(fù)溶，待凈化。

（2） 樣品凈化。于復(fù)溶液中加入正己烷4 mL，渦旋1 min，于低溫5 ℃下以轉(zhuǎn)速10 000 r/min 離心5 min，取下層溶液過0.2 μm 有機(jī)濾膜，供高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.2.3 色譜條件

色譜柱為Waters ACQUITY HSS T3 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流速0.3 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量1 μL，流動(dòng)相A 為0.1 %甲酸水，B 為乙腈，梯度洗脫0～0.5 min，95%A；0.5～6.5 min，95%～80%A；6.5～7.0 min，80%～10%A；7.0～7.1 mim，10%～95%A；7.1～9.0 min，95%A。

1.2.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）：正離子掃描；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），噴霧電壓5.5 kV，氣簾氣40 psi，噴霧氣45 psi，輔助氣40 psi，離子源溫度500 ℃。

馬波沙星和馬波沙星-D8的MRM參數(shù)見表1。

表1 馬波沙星和馬波沙星-D8 的MRM 參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件的確定

馬波沙星屬于氟喹諾酮類藥物，分子結(jié)構(gòu)含有多個(gè)N 原子而顯一定的弱堿性，因此選擇正離子模式電離。分別取質(zhì)量濃度1 μg/mL 的馬波沙星和1 μg/mL 的馬波沙星-D8溶液進(jìn)行全掃描，得到相應(yīng)的準(zhǔn)分子離子分，確定母離子。調(diào)整電離電壓和離子源溫度使母離子響應(yīng)值最佳，最終確定電離電壓為5.5 kV，離子源溫度為500 ℃。對(duì)母離子進(jìn)行子離子全掃描，確定定量離子對(duì)和定性離子對(duì)，并優(yōu)化去簇電壓和碰撞能量，確定最佳參數(shù)。

2.1.2 色譜條件的確定

馬波沙星極性弱，具有良好的脂溶性，在反相C18色譜柱上具有良好的保留，選擇具有高分離能力、高耐壓性和pH 值適用范圍廣的Waters ACQUITY HSS T3 （2.1 mm×100 mm，1.8 μm） 色譜柱，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在該色譜柱條件下，目標(biāo)化合物分離效果好、峰型尖銳對(duì)稱。試驗(yàn)比較了水- 甲醇、水- 乙腈、0.1%甲酸水- 甲醇和0.1%甲酸水- 乙腈4 種流動(dòng)相體系下的色譜峰形及響應(yīng)值，發(fā)現(xiàn)用0.1%甲酸水- 乙腈作流動(dòng)相時(shí)，目標(biāo)化合物具有良好的響應(yīng)，保留穩(wěn)定、峰型好，柱壓也較低，因此確定0.1%甲酸水- 乙腈為流動(dòng)相。在此條件下，馬波沙星MRM總離子流色譜圖。

馬波沙星的總離子流色譜圖見圖1。

圖1 馬波沙星的總離子流色譜圖

2.2 提取溶劑的選擇

動(dòng)物肌肉、內(nèi)臟、脂肪和生鮮乳中含量較高的蛋白質(zhì)和脂肪，對(duì)目標(biāo)物的提取和后續(xù)的檢測(cè)有較大的干擾，提取溶劑應(yīng)能最大限度地減少此類物質(zhì)的提出。在常用的提取溶劑中，因馬波沙星在乙腈中具有良好的溶解性，且乙腈具有一定的蛋白沉淀作用，高速離心后可去除一定量的蛋白，同時(shí)乙腈能減少對(duì)脂肪的提取，因此選擇乙腈作為提取溶劑，能獲較好的回收率。由于馬波沙星的分子結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)N 原子，具有弱堿性，加入適量的乙酸使其離子化，增加極性，有利于提高馬波沙星在乙腈中的溶解度，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)使用1%的乙酸乙腈提取時(shí)，在有效去除干擾雜質(zhì)的同時(shí)能獲得良好的回收率。最終確定1%的乙酸乙腈作為提取溶劑。

2.3 凈化方式的選擇

試驗(yàn)比較了3 種凈化方式：一是樣品經(jīng)1%乙酸乙腈提取、氮?dú)獯蹈伞?.1%甲酸水+甲醇（9+1） 復(fù)溶處理后，復(fù)溶液過0.22 μm 有機(jī)濾膜后直接上機(jī)測(cè)定；二是樣品經(jīng)1%乙酸乙腈提取后，加入適量正己烷除脂，氮?dú)獯蹈桑?.1%甲酸水+甲醇（9+1） 復(fù)溶后過0.22 μm 有機(jī)濾膜；三是樣品經(jīng)1%乙酸乙腈提取、氮?dú)獯蹈伞?.1%甲酸水+甲醇（9+1） 復(fù)溶后，復(fù)溶液經(jīng)正己烷脫脂，取下層溶液過0.22 μm濾膜后上機(jī)測(cè)定。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，方法一未能有效地達(dá)到凈化的目的，得到的色譜圖雜峰較多、干擾大，較多的雜質(zhì)還可能對(duì)儀器造成污染及損害；方法二和方法三得到的色譜圖基本一致，雜峰少、干擾小，但方法二需要消耗更多量的正己烷，綜合考慮凈化效果、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等因素，最終確定復(fù)溶后再脫脂的凈化方式。

2.4 復(fù)溶液的選擇

分別考查了乙腈：0.1%甲酸水（20∶80，V∶V）、乙腈：0.1%甲酸水（10∶90，V∶V）、甲醇：0.1%甲酸（20∶80，V∶V）、甲醇：0.1%甲酸水（10∶90，V∶V） 等4 種溶劑作為樣品氮?dú)獯蹈珊蟮膹?fù)溶液，對(duì)目標(biāo)物的響應(yīng)值和峰型的影響。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)復(fù)溶液中有機(jī)相為乙腈時(shí)，雖然色譜峰峰型較好，但背景干擾比有機(jī)相為甲醇的復(fù)溶液時(shí)的背景干擾高；而當(dāng)有機(jī)相為甲醇時(shí)，過高甲醇濃度會(huì)抑制目標(biāo)物的響應(yīng)。因此，最終確定樣品復(fù)溶液為甲醇：0.1%甲酸水（10∶90，V∶V）。

2.5 方法學(xué)的驗(yàn)證

2.5.1 線性范圍和定量限、檢出限

取“1.3.1”制備的馬波沙星質(zhì)量濃度為5，20，50，100，200，400 μg/L，馬波沙星-D8質(zhì)量濃度均為10 g/L 的馬波沙星系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，供液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定，以馬波沙星與馬波沙星-D8的峰面積比值為縱坐標(biāo)（Y），馬波沙星的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，在5.0～400.0 ng/mL 的濃度范圍內(nèi)，馬波沙星呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=0.235 67X-0.286 85，相關(guān)系數(shù)（R） 為0.999 6。在各基質(zhì)中添加適量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以信噪比S/N＞3，確定檢出限（Limit of Detection，LOD） 為1.5 μg/kg；以信噪比S/N＞10，確定量限（Limit of quantitation，LOQ） 為5.0 μg/kg。

2.5.2 準(zhǔn)確度和精密度

采用添加回收的方法考查該方法的準(zhǔn)確度和精密度。根據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)獸藥殘留檢測(cè)方法精密度和準(zhǔn)確度的規(guī)定[26]，分別在豬肌肉、肝臟、腎臟和脂肪，以及牛肌肉、脂肪、肝臟、腎臟和牛奶的空白基質(zhì)中添加適量馬波沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液，每種空白基質(zhì)添加4 個(gè)質(zhì)量濃度水平，每個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)行3 批試驗(yàn)，每批5 個(gè)平行樣品，按“1.3”的試驗(yàn)方法進(jìn)行前處理測(cè)定，分別計(jì)算每批單獨(dú)試驗(yàn)的批內(nèi)平均回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD） 和全部批次的批間平均回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

馬波沙星的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見表2。

由表2 可知，肌肉、肝臟、腎臟添加質(zhì)量濃度為5.0～300.0 μg/kg 時(shí)、脂肪添加質(zhì)量濃度為5.0～100.0 μg/kg 時(shí)、牛奶添加質(zhì)量濃度為5.0～150.0 μg/kg時(shí)，馬波沙星的平均回收率為82.6%～108.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.45%～6.86%，該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

使用該方法對(duì)市場(chǎng)采購的牛肉、牛肝、牛腎、牛脂肪、牛奶、豬肉、豬肝、豬腎、豬脂肪等各10 批樣品進(jìn)行檢測(cè)，均未檢出馬波沙星。

3 結(jié)論

建立了一種能同時(shí)滿足牛肉、牛肝、牛腎、牛脂肪、牛奶、豬肉、豬肝、豬腎和豬脂肪等9 種動(dòng)物基質(zhì)中馬波沙星殘留檢測(cè)的高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法。該方法前處理簡單、靈敏度高、重現(xiàn)性好、涵蓋多種動(dòng)物組織，適用于動(dòng)物源性食品中馬波沙星殘留的快速檢測(cè)。