緊密連接蛋白介導(dǎo)的十三味辛夷滴鼻劑對小鼠鼻腔黏膜修復(fù)機(jī)制探究

楊 鈐 楊履世 賈力莉 宋美卿 牛艷艷 吉海杰 仲啟明 馮瑪莉▲

1.山西省中醫(yī)院臨床藥理重點實驗室，山西太原 030012；2.山西黃河中藥有限公司，山西太原 030012

十三味辛夷滴鼻劑是古方蒼耳子散、川芎茶調(diào)散和加味通關(guān)散的合方。蒼耳子散出自《濟(jì)生方》，由蒼耳子、辛夷、白芷、薄荷組成，是治療鼻炎的第一經(jīng)典藥方[1]；川芎茶調(diào)散始見于宋代的官方醫(yī)典《太平惠民和劑局方·卷之二治傷寒》，由薄荷、川芎、荊芥、羌活、白芷、甘草、防風(fēng)、細(xì)辛八味藥組成，為“諸經(jīng)頭痛之要藥”，治療頭痛的同時養(yǎng)護(hù)鼻腔黏膜[2]；加味通關(guān)散來源于古方通關(guān)散，首見于《丹溪心法附余》，由豬牙皂、細(xì)辛、麝香、冰片組成，增強(qiáng)醒神通竅[3]。三藥合用，辛溫散寒、通竅止痛、消炎解毒。

鼻炎是由各種理化因素、生物因子及免疫相關(guān)疾病等誘發(fā)的鼻黏膜的炎性反應(yīng)，病理改變?yōu)轲つこ溲⑺[、滲出、增生、萎縮甚至壞死等。鼻黏膜修復(fù)對于減輕炎性反應(yīng)、恢復(fù)組織病理結(jié)構(gòu)、形成保護(hù)屏障、防御病原微生物入侵等具有重要作用。

本研究通過制備小鼠鼻黏膜熱損傷模型以及十三味辛夷滴鼻劑滴鼻給藥，觀察鼻腔黏膜紅腫、病理改變，檢測鼻黏膜上皮細(xì)胞ZO-1、Claudin-1和Occludin表達(dá)，以期為十三味辛夷滴鼻劑對鼻黏膜損傷的修復(fù)作用及可能的作用機(jī)制提供實驗證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物

十三味辛夷滴鼻劑（山西黃河中藥有限公司，國藥準(zhǔn)字B20020131，批號：20201001，規(guī)格：6 ml/瓶）；用時以十三味辛夷滴鼻劑∶溶媒（不含十三味辛夷滴鼻劑藥味的基質(zhì)）=1∶0、1∶1、1∶3分別稀釋為高、中、低不同濃度的混懸液。

滴通鼻炎水（廣州白云山制藥股份有限公司白云山外用藥廠，國藥準(zhǔn)字Z44022586，批號：F2019，規(guī)格：15 ml/瓶）；用時以滴通鼻炎水∶生理鹽水=1∶4稀釋為混懸液。

1.2 動物

小鼠：KM種，SPF級，體重18～22 g，共60只，雌、雄各半，購自北京華阜康生物科技股份有限公司[生產(chǎn)許可證：SCXK（京）2019-0008，質(zhì)量合格證：110322210100720285]。飼養(yǎng)于山西省中醫(yī)藥研究院臨床藥理重點實驗室動物房（符合動物實驗通用要求），相對濕度40%～60%，室溫：22±1℃：自由飲水、攝食。本研究經(jīng)山西省中醫(yī)院（本院）倫理委員會審查，實驗中涉及的動物處理方法符合國家相關(guān)法規(guī)（批件號：2021-07028）。

1.3 試劑

ZO-1抗體（bs-1329R）、Claudin-1抗體（bs-1428R）、Occludin抗體（bs-10011R）、免疫組化檢測試劑盒（SP-0023），購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.4 儀器

全自動組織脫水機(jī)（Excelsior）、旋轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)（F325）、全自動染色機(jī)（Gemini AS），產(chǎn)自美國Thermo；熒光顯微鏡（BX51-DP72），產(chǎn)自日本Olympus。

1.5 方法

1.5.1 分組 記錄小鼠體重，按照“均衡隨機(jī)”的方法分為空白對照組、模型對照組、滴通鼻炎水陽性對照組[1 μl/（只·次·側(cè)）]、十三味辛夷滴鼻劑高劑量[5 μl/（只·次·側(cè)）]、中劑量[2.5 μl/（只·次·側(cè)）]、低劑量組[1.25 μl/（只·次·側(cè)）]，每組各10只，雌雄各半。

1.5.2 鼻腔黏膜損傷小鼠模型制備 模型組與各給藥組小鼠，用70℃蒸餾水50 μl×30次（每分鐘1次）滴在雙鼻中隔黏膜制備模型。

1.5.3 滴鼻給藥 滴通鼻炎水陽性對照組給予滴通鼻炎水混懸液，十三味辛夷滴鼻劑高、中、低劑量組分別給予相應(yīng)劑量的十三味辛夷滴鼻劑混懸液，頭部斜下方20°滴入鼻腔兩側(cè)，停留30 s，2次/d，連續(xù)7 d。

1.5.4 鼻黏膜紅腫觀察與分級評定 滴鼻7 d后，通過肉眼觀察小鼠鼻中隔黏膜（包含軟骨部分）的紅腫狀況，依據(jù)“局部黏膜刺激反應(yīng)分級標(biāo)準(zhǔn)”進(jìn)行分級評分[4]。0度：未觀察到任何損傷跡象，鼻黏膜無腫脹、淤血現(xiàn)象，記為0分。1度：發(fā)現(xiàn)輕微損傷，鼻黏膜出現(xiàn)腫脹，但未伴隨淤血，記為1分。2度：損傷程度中等，鼻黏膜既腫脹又出現(xiàn)淤血，記為2分。

1.5.5 鼻黏膜組織病理學(xué)觀察 滴鼻7 d后，檢取小鼠鼻中隔黏膜（包括軟骨部分）。將組織在10%的福爾馬林溶液中固定12 h，之后轉(zhuǎn)移到10%EDTA脫鈣液中脫鈣72 h。按照常規(guī)的病理學(xué)制片流程，對樣本進(jìn)行脫水、包埋和切片處理。進(jìn)行蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后，光鏡下觀察小鼠鼻黏膜的組織結(jié)構(gòu)的改變。

1.5.6 鼻黏膜上皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin的免疫組化檢測 采用免疫組化技術(shù)檢測鼻黏膜上皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin的表達(dá)水平，具體步驟如下。①抗原修復(fù)：將石蠟切片脫蠟后放入0.01 M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH 6.0）中，通過微波爐加熱進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫。②阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：在切片上滴加內(nèi)源性過氧化物酶封閉液，室溫孵育10 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。用PBS緩沖溶液洗滌樣本3次，每次3 min。③封閉非特異性抗原：在切片上滴加正常山羊血清工作液，室溫封閉10 min。④一抗孵育：用吸水紙吸去封閉液，加入足量的一抗工作液（ZO-1：1∶250，Claudin-1：1∶200，Occludin：1∶400），放入濕盒中，4℃孵育過夜。用PBS緩沖溶液洗滌樣本3次，每次3 min。⑤二抗孵育：切片上滴加二抗工作液，室溫孵育20 min。用PBS緩沖溶液洗滌樣本3次，每次3 min。⑥鏈霉親和素孵育：切片上滴加HRP標(biāo)記的鏈霉親和素溶液，室溫孵育20 min。用PBS緩沖溶液洗滌樣本3次，每次3 min。⑦顯色反應(yīng)：滴加DAB工作液顯色5～10 min，顯微鏡下控制顯色程度。⑧復(fù)染和封片：切片充分水洗后，用蘇木素進(jìn)行復(fù)染20 s，用1%鹽酸分化10 s，用1%氨水返藍(lán)10 s。然后進(jìn)行梯度酒精脫水、透明和中性樹膠封片。同時進(jìn)行空白對照實驗。⑨結(jié)果分析：在光學(xué)顯微鏡20×10倍下隨機(jī)采集5個視野的圖像，使用Image J 1.52a軟件計算每張切片的平均光密度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

使用GraphPad Prism 7.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)經(jīng)過正態(tài)化處理后，采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，統(tǒng)計學(xué)方法選擇單因素方差分析（ANOVA），并結(jié)合Dunnett-t檢驗，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 十三味辛夷滴鼻劑對小鼠鼻黏膜損傷紅腫程度的影響

模型對照組鼻黏膜紅腫程度評分高于空白對照組（P＜ 0.05）；與模型對照組比較，滴通鼻炎水陽性對照組、十三味辛夷滴鼻劑高、中、低劑量組評分均降低，且隨劑量增高，呈降低趨勢。見表1。

表1 十三味辛夷滴鼻劑對小鼠鼻黏膜損傷紅腫程度的影響（n=10，±s）

表1 十三味辛夷滴鼻劑對小鼠鼻黏膜損傷紅腫程度的影響（n=10，±s）

組別紅腫評分（分）空白對照組 0.707±0.025a模型對照組0.781±0.064滴通鼻炎水陽性對照組0.739±0.042十三味辛夷滴鼻劑高劑量組0.737±0.053十三味辛夷滴鼻劑中劑量組0.753±0.051十三味辛夷滴鼻劑低劑量組0.768±0.054

注 與模型對照組比較，aP ＜ 0.05

2.2 十三味辛夷滴鼻劑對小鼠鼻黏膜組織病理結(jié)構(gòu)的影響

空白對照組中，小鼠鼻黏膜上皮細(xì)胞呈現(xiàn)規(guī)則的假復(fù)層柱狀排列，可見正常的杯狀細(xì)胞，固有層毛細(xì)血管、分泌腺結(jié)構(gòu)清晰。模型對照組中，小鼠的鼻黏膜呈現(xiàn)出明顯的增厚和結(jié)構(gòu)紊亂：上皮細(xì)胞出現(xiàn)剝脫，杯狀細(xì)胞肥大，基底膜層受到破壞，固有層間質(zhì)出現(xiàn)水腫，毛細(xì)血管擴(kuò)張明顯，腺體和腺管也出現(xiàn)肥大和擴(kuò)張，炎癥細(xì)胞大量浸潤。與模型對照組比較，滴通鼻炎水陽性對照組組織結(jié)構(gòu)明顯改善；十三味辛夷滴鼻劑高、中、低劑量組呈現(xiàn)不同程度改善，隨劑量增高，組織結(jié)構(gòu)明顯好轉(zhuǎn)。見圖1。

圖1 十三味辛夷滴鼻劑對小鼠鼻黏膜損傷組織病理學(xué)的影響（HE染色，200×）

2.3 十三味辛夷滴鼻劑對小鼠鼻黏膜上皮細(xì)胞ZO-1、Claudin-1、Occludin表達(dá)的影響

與模型對照組比較，空白對照組、滴通鼻炎水陽性對照組及十三味辛夷滴鼻劑高、中、低劑量組ZO-1蛋白表達(dá)量增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。與模型對照組比較，空白對照組、滴通鼻炎水陽性對照組、十三味辛夷滴鼻劑高劑量組Claudin-1蛋白表達(dá)量顯著增高（P＜ 0.05）；十三味辛夷滴鼻劑中、低劑量組的Claudin-1蛋白表達(dá)量無顯著改變（P＞ 0.05）。與模型對照組比較，空白對照組、滴通鼻炎水陽性對照組、十三味辛夷滴鼻劑高、中劑量組Occludin蛋白表達(dá)量顯著增高（P＜ 0.05）；十三味辛夷滴鼻劑低劑量組Occludin蛋白表達(dá)量無顯著改變（P＞ 0.05）。見表2、圖2。

圖2 十三味辛夷滴鼻劑對小鼠鼻黏膜上皮細(xì)胞ZO-1、Claudin-1、Occludin表達(dá)的影響（免疫組化，200×）

表2 十三味辛夷滴鼻劑對小鼠鼻黏膜上皮細(xì)胞ZO-1、Claudin-1、Occludin表達(dá)的影響（n=10，±s）

表2 十三味辛夷滴鼻劑對小鼠鼻黏膜上皮細(xì)胞ZO-1、Claudin-1、Occludin表達(dá)的影響（n=10，±s）

組別ZO-1Claudin-1Occludin空白對照組0.286±0.008a0.282±0.010a0.254±0.010a模型對照組0.220±0.0090.237±0.0140.230±0.014滴通鼻炎水陽性對照組0.296±0.011a0.297±0.044a0.267±0.002a十三味辛夷滴鼻劑高劑量組0.291±0.025a0.280±0.016a0.264±0.004a十三味辛夷滴鼻劑中劑量組0.258±0.019a0.256±0.0120.256±0.005a十三味辛夷滴鼻劑低劑量組0.272±0.019a0.252±0.0200.242±0.005

注 與模型對照組比較，aP ＜ 0.05

3 討論

十三味辛夷滴鼻劑由蒼耳子、辛夷、白芷、細(xì)辛、蓽茇、當(dāng)歸、魚腥草、荊芥、沙棘、鵝不食草、人工麝香、薄荷腦、冰片等藥味組成，是廣泛用于臨床治療各種鼻炎、鼻竇炎的外用純中藥復(fù)方制劑，表現(xiàn)出顯著的“修”（修復(fù)鼻腔黏膜損傷）和“排”（促進(jìn)濃涕排出）的作用。方中蒼耳子、辛夷為君藥，散風(fēng)寒、通鼻竅；白芷、細(xì)辛、鵝不食草為臣藥，祛風(fēng)散寒、通竅止痛；佐以麝香、薄荷腦芳香走竄，并以冰片、魚腥草清熱解毒、消炎止痛，制君藥之辛溫太過；當(dāng)歸、荊芥穗活血補(bǔ)血、疏風(fēng)止痛。本品辛溫散寒、通竅止痛、消炎解毒，具有良好的抗病毒、抗菌消炎、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫功能、黏膜修復(fù)的藥理作用。

針對物理誘因制備鼻黏膜損傷模型的實驗研究發(fā)現(xiàn)，艾煙環(huán)境、輻照、低氧、光動力療法、PM2.5等會引起鼻黏膜組織病理結(jié)構(gòu)改變，誘發(fā)黏膜上皮屏障損傷和炎性反應(yīng)[5-9]；此外，用50℃或70℃的生理鹽水滴鼻30次（每分鐘1次）刺激大鼠鼻中隔黏膜，均可引起黏膜組織病理結(jié)構(gòu)改變；50℃滴鼻組15 d后可自行恢復(fù)，但70℃滴鼻組第28天僅可見少數(shù)恢復(fù)[10]。

緊密連接（tight junctions，TJs）、黏附連接、橋粒及縫隙連接是鼻黏膜上皮細(xì)胞間的主要連接方式[11]。其中，TJs是一種大分子復(fù)合物，由跨膜蛋白Occludin、Claudin、胞質(zhì)附著蛋白ZO家族、JAMs以及細(xì)胞骨架蛋白等構(gòu)成連續(xù)的帶狀結(jié)構(gòu)，圍繞著上皮或內(nèi)皮細(xì)胞的頂端將相鄰細(xì)胞連接在一起，形成表皮滲透屏障、維持屏障功能[12-13]。Occludin是第一種被發(fā)現(xiàn)的緊密連接跨膜蛋白，參與調(diào)控旁細(xì)胞通透性及維持細(xì)胞極性[14]。在糖化終產(chǎn)物受體（receptor for advanced glucation end products，RAGE）和其配體高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein box-1，HMGB1）導(dǎo)致的氣道上皮細(xì)胞屏障功能損傷中，Occludin發(fā)揮重要作用，對RAGE和HMGB1的抑制能顯著提高Occludin等蛋白的表達(dá)，維持氣道上皮的完整性[15]。細(xì)胞中高濃度的蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）會使Occludin蛋白去磷酸化，降低跨膜電阻值（trans-epithelium electrical resistant，TER），進(jìn)而降低細(xì)胞極性和細(xì)胞間通透性[16]。Claudin蛋白家族的27個成員廣泛分布于各種上皮和內(nèi)皮細(xì)胞之間。Claudin-1是一種在各種上皮組織中廣泛表達(dá)的蛋白，是機(jī)體旁細(xì)胞屏障中最重要的TJs蛋白。有研究顯示，當(dāng)小鼠的Claudin-1基因被敲除時，它們出現(xiàn)了電解質(zhì)和水分的大量流失，僅能存活1天[17]。此外，胞漿蛋白ZO-1在TJs的組裝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起到關(guān)鍵作用。當(dāng)ZO-1基因的表達(dá)被降低時，會導(dǎo)致肌動蛋白和肌球蛋白的結(jié)構(gòu)變化，從而降低MDCK單層細(xì)胞的TER值，并增加示蹤分子的透過率[18]。

前期研究中，本課題組參考文獻(xiàn)[9]，基于模型制備的可操作性與黏膜損傷持續(xù)的時間，探索建立了一種制備小鼠鼻黏膜熱損傷模型的方法：具體操作是將50 μl 70℃的蒸餾水對小鼠雙鼻中隔黏膜進(jìn)行30次滴注，每次滴注間隔1 min。經(jīng)十三味辛夷滴鼻劑高劑量滴鼻治療7 d后，由熱刺激導(dǎo)致的鼻黏膜損傷紅腫程度明顯減輕，鼻黏膜表皮完整性、上皮細(xì)胞水腫程度、杯狀細(xì)胞肥大、間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤、黏膜厚度等明顯改善，且能明顯上調(diào)ZO-1、Claudin-1、Occludin蛋白表達(dá)。本研究結(jié)果證實十三味辛夷滴鼻劑可能通過上調(diào)鼻黏膜上皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin表達(dá)，修復(fù)鼻腔黏膜保護(hù)屏障、維持細(xì)胞極性，防御病原微生物入侵，減輕炎性反應(yīng)，達(dá)到消炎解毒、通竅止痛的功效。