醫療機構制劑補腎生精片質量標準提升研究

陳宗文 陳燕顏 盧偉寧 江洪亮

廣東省高州市中醫院制劑科，廣東高州 525200

補腎生精片為潘茂名弟子傳承下來的醫療機構制劑注冊品種（批準文號：粵藥制字Z05170158），具有超過20年的臨床應用歷史。本品具補腎壯陽，生精之功效，用于男子精子數少、活動力或活動率差、死精等，已經為廣大不育男性患者帶來福音，值得進一步完善其理論體系及市場化開發利用。原該制劑的注冊標準只有黃芪、山茱萸的薄層鑒別以及山藥的顯微鑒別，已經不能滿足本品市場化的需求及質量標準提高的要求。本研究參照《制劑質量研究及標準制定指導原則》，對該注冊制劑品種質量標準提升進行研究，為本品市場化及實際生產提供實驗依據及質量控制標準。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與材料

JJ124BF型電子分析天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；SB25-12DTD超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；RIGOL L-3000型高效液相色譜儀（北京普源精電科技有限公司）；Rigol Compass C18（2）色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；WFH-201BJ型紫外可見透射反射儀（上海精科實業有限公司）；薄層層析用硅膠G、硅膠GF254（青島海洋化工廠分廠）。

1.2 試藥與試劑

補腎生精片（批號：20210812、20210908、20211006）及各陰性樣品均由高州市中醫院制劑室提供；淫羊藿苷（批號：110737-201516）、熟地黃對照藥材（批號：121196-201406）、巴戟天對照藥材（批號：121163-201405）均購于中國藥品生物制品檢定所；試劑：流動相為色譜純，其余為分析純。

2 方法與結果

2.1 定性鑒別

2.1.1 淫羊藿[1-2]取本品細粉6 g，加70%乙醇溶液50 ml，玻璃棒攪拌下溶解，超聲30 min，過濾，濾液蒸干，殘渣加入30 ml熱水，玻璃棒攪拌下溶解，置分液漏斗以水飽和正丁醇振蕩提取3次，30 ml/次，合并正丁醇液，再以氨水振蕩洗滌3次，30 ml/次，下層濃氨試液棄去，上層正丁醇液置蒸發皿中蒸干，殘渣加入2 ml乙醇使溶解，制成淫羊藿供試品溶液。再稱取缺淫羊藿陰性樣品細粉6 g，自“置三角燒瓶中，加70%乙醇溶液50 ml，玻璃棒攪拌下溶解，超聲30 min”起制成陰性對照溶液。另取淫羊藿苷適量，加甲醇定容并超聲溶解，制成0.135 mg/ml對照品溶液。按薄層層析法，于同一硅膠G薄層板上分別點樣對照品、供試品及陰性對照溶液8、1、1 μl，以乙酸乙酯∶丁酮∶甲酸∶水=8∶1∶1∶1預飽和15 min，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加熱至斑點清晰，365 nm熒光下檢視。相比對照品色譜，供試品顯相同的綠色或黃綠色熒光斑點，且陰性對照無干擾斑點。見圖1。

圖1 淫羊藿薄層色譜圖（紫外365 nm）

2.1.2 鹽巴戟天[3-4]取本品細粉6g，置三角燒瓶中，加入乙醇50 ml，玻璃棒攪拌下溶解，超聲15 min，過濾，蒸干，殘渣加入熱水50 ml，玻璃棒攪拌下溶解，二氯甲烷振搖提取2次，20 ml/次，合并二氯甲烷液，置蒸發皿中放置通風櫥內揮干，殘渣用2 ml無水乙醇溶解，制成鹽巴戟天供試品溶液。取缺鹽巴戟天樣品6 g，同法制成鹽巴戟天陰性對照溶液。再取巴戟天對照藥材2.5 g，置圓底燒瓶中，加入乙醇25 ml，置回流裝置上加熱1 h，中速濾紙濾過，濾液置蒸發皿中蒸干，自“殘渣加入熱水50 ml，玻璃棒攪拌下溶解”起制成巴戟天對照藥材溶液。按薄層層析法，點樣于同一硅膠G薄層板上，巴戟天對照藥材、鹽巴戟天供試品及鹽巴戟天陰性對照溶液分別為1、2、2 μl，以甲苯 : 乙酸乙酯：甲酸=8∶4∶0.1預飽和15 min，展開，取出，晾干，365 nm熒光下檢視。相比對照藥材色譜，供試品顯相同的藍色或藍白色熒光斑點，且陰性對照無干擾熒光斑點，見圖2。

圖2 鹽巴戟天薄層色譜圖（紫外365 nm）

2.1.3 熟地黃[5-7]取本品細粉2 g，置三角燒瓶中，加入甲醇30 ml，置超聲儀上并設定溫度為45℃，超聲30 min，過濾，蒸干，殘渣加入熱水30 ml，玻璃棒攪拌下溶解，水飽和正丁醇提取3次，30 ml/次，合并正丁醇液，以正丁醇飽和的水洗滌2次，60 ml/次，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇2 ml溶解，制成供試品溶液。再取缺熟地黃陰性樣品細粉2 g，自“置三角燒瓶中，加入甲醇50 ml，置超聲儀上并設定溫度為45℃，超聲30 min”起制成陰性對照溶液。另取熟地黃對照藥材2 g，自“置三角燒瓶中，加入甲醇30 ml，置超聲儀上并設定溫度為45℃，超聲30 min”起制成對照藥材溶液。按薄層層析法，點樣于同一硅膠GF254薄層板上，對照藥材、供試品及陰性對照溶液分別為10、3、3 μl，以石油醚（60～90℃） ∶乙酸乙酯=1∶1為展開劑，預飽和15 min，展開，取出，晾干，254 nm熒光下檢視。相比對照藥材色譜，供試品顯相同淺黑色或黑色熒光斑點，且陰性對照無干擾熒光斑點，見圖3。

圖3 熟地黃薄層圖譜圖（紫外254 nm）

2.2 淫羊藿苷含量測定[8-12]

2.2.1 對照品溶液的制備 取淫羊藿苷0.0135 g，加甲醇定容至100 ml，超聲溶解，制成對照品溶液（0.135 mg/ml）。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品細粉約7.5 g，精密稱定，同“2.1.1 淫羊藿”供試品制備方法，制得“殘渣”用無水乙醇溶解，轉移至5 ml量瓶中，加無水乙醇定容至刻度，搖勻后用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 取缺淫羊藿陰性樣品細粉約7.5 g，精密稱定，同“2.2.2”制成陰性對照溶液。

2.2.4 色譜條件[13]色譜柱：Rigol Compass C18（2）柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相乙腈∶水=28∶72（v/v），柱溫30℃，檢測波長270 nm，流速1.0 ml/min，進樣量10 μl，淫羊藿苷峰理論板數≥3000。

2.2.5 方法學考察[14]系統適用性試驗：取上述對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各10 μl（平行2次），按“2.2.4”色譜條件進樣測定，結果顯示供試品與對照品色譜相應的保留時間出現相應的淫羊藿苷峰，而陰性對照在該處無該淫羊藿苷峰，分離度＞2.0，理論板數按淫羊藿苷峰計算≥3000。見圖4～6。

圖4 淫羊藿苷對照品

圖5 供試品

圖6 淫羊藿陰性對照

線性關系考察：分別取淫羊藿苷對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成質量濃度為0.025、0.050、0.100、0.200、0.300 mg/ml的對照品溶液。每個濃度組進樣10 μl（每組進樣兩次），按“2.2.4”色譜條件項測定，記錄淫羊藿苷峰面積。以淫羊藿苷濃度（mg/ml）為x坐標軸、平均峰面積為y坐標軸，計算得線性回歸方程及質量濃度范圍分別為：y=13 524.5915x-22.6651（R2=0.9999），淫羊藿苷在0.025～0.300 mg/ml區間內呈良好的線性關系。見圖7。

圖7 淫羊藿苷線性關系考察擬合方程

精密度試驗：取適量“2.2.1”項對照品溶液，按“2.2.4”項色譜條件，連續進樣同一對照品溶液6次，每次進樣量為10 μl，記錄各峰面積。結果RSD為1.27%，表明該色譜儀精密度良好。

穩定性試驗：取“2.2.2”項同一供試品溶液適量（批號：20210812），室溫放置0、4、8、10、12 h后，按“2.2.4”項色譜條件，進樣10 μl（平行2次）測定，記錄各淫羊藿苷峰面積，計算出RSD為1.63%（n=5），表明在室溫下12 h內供試液的性質穩定。

重復性試驗：取同批次樣品（批號：20210812）約7.5 g，精密稱定，按“2.2.2”項制備供試品溶液，共6份，再按“2.2.4”項色譜條件進樣測定，進樣量為10 μl，得淫羊藿苷的平均含量為0.14 mg/mg，計算出RSD為1.84%（n=6），表明本品含量測定方法重復性良好。

加樣回收率試驗：取同批次（批號：20210812），已知淫羊藿苷含量6個樣品，每份約7.5 g，精密稱定，置100 ml錐形瓶中，按“2.2.2”項下制備供試品溶，共6份，各精密量取0.5 ml，分別加入濃度為0.135 mg/ml的淫羊藿苷對照品試液1.1 ml，充分搖動直到混合均一，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，再按“2.2.4”項下色譜條件進樣測定，進樣量為10 μl，記錄峰面積，計算平均加樣回收率為103.51%，RSD為1.44%，結果顯示該方法具有良好的回收率。見表1。

表1 淫羊藿苷加樣回收率試驗結果（n=6）

樣品中淫羊藿苷含量測定：取連續3批次樣品約7.5 g，精密稱定，置100 ml錐形瓶中，分別按“2.2.2”項制備供試品溶，再按“2.2.4”項下色譜條件進樣測定，進樣量為10 μl，平行2次進樣。見表2。

表2 補腎生精片中淫羊藿苷的測定結果（n=2）

3 討論

本研究在原制劑注冊標準的基礎上增加了淫羊藿、鹽巴戟天、熟地黃三味藥材的薄層鑒別方法。經過方法學考察，新增三味藥材薄層鑒別色譜特征斑點明顯，陰性對照無干擾，可納入該品種制劑質量標準。

在含量測定中采用了兩種方法制備本品供試品：方法一參考《中華人民共和國藥典》2020年版淫羊藿“含量測定”[15]下的供試品制備方法，結果檢測的雜質成分多、淫羊藿苷色譜峰不明顯；方法二參考定性鑒別中“2.1.1淫羊藿”的供試品制備方法，結果顯示經提純后的供試品雜質成分少、淫羊藿苷色譜峰明顯。后經方法學驗證，方法二的供試品制備方法重現性好、成分穩定性好。如該制劑市場化，可以把本品所含淫羊藿苷的含量作為質量控制指標申請藥品注冊批件。