連翹復配黃芩茵陳涂膜劑的制備及在鮮豬肉保鮮中的應用效果

何 皎，牛明福，張改平

（1.河南科技大學食品與生物工程學院，河南洛陽 471000；2.食品微生物河南省工程研究中心，河南洛陽 471000；3.河南科技大學微生物資源開發與利用校級重點實驗室，河南洛陽 471000；4.食品原料河南省工程技術研究中心，河南洛陽 471000）

鮮豬肉有風味獨特、營養價值高的特點，是中國餐桌最為常見的食用肉類，但其保質短、易變質。鮮豬肉的變質主要是微生物的滋生和脂肪的氧化，食用變質豬肉會引起腹瀉、嘔吐等癥狀，甚至會引起菌血癥，因此開發保鮮效果好的防腐劑用于豬肉保鮮具有非常重要的意義。在食品工業中，傳統化學防腐劑因其潛在危害越來越不被人們接受[1-2]，新型天然防腐劑越來越受到消費者的歡迎。研究表明，許多常用中藥具有很好的抑菌和抗氧化活性，可作為高效低毒的食品防腐劑用于食品防腐保鮮[3-4]。

茵陳具有抑菌性能，能夠抑制霉菌和致病菌的生長[5-7]；連翹對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等均具有較好的抑菌作用；黃芩在抗氧化、抗衰老、增強免疫調節及治療心血管疾病等很多方面都表現極好[8-9]，這三者是傳統處方藥甘露消毒丸的主要成分。因此，以它們的提取物作為新型保鮮防腐劑具有天然性、食用安全性高等優勢。采用單因素試驗結合響應面優化設計的方法，以甘露消毒丸的配伍比例為基礎，將連翹、茵陳和黃芩進行復配醇提，并進行醇提物活性研究，確定了復配方劑發揮活性的最佳比例、最佳醇提條件，比較了復配前后的抑菌和抗氧化活性，同時驗證了提取液與涂膜劑在鮮豬肉中的保鮮效果，為開發新型中藥類鮮豬肉防腐劑提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

連翹、茵陳、黃芩、維C 等，購自洛陽市張仲景大藥房；鮮豬肉，購自洛陽市大張超市；胰蛋白胨、牛肉膏、瓊脂粉、葡萄糖等，北京奧博星生物技術有限責任公司提供；無水乙醇、氯化鈉、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁等，均為分析純；尼泊金甲酯，味多美實業有限公司提供；C3500 型厭氧產氣袋，三菱瓦斯化學株式會社提供；T-AOC 型檢測試劑盒，上海生工生物工程股份有限公司提供。

1.1.2 菌種

沙門氏菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌、意大利青霉、指狀青霉等菌種，河南科技大學微生物資源開發與利用校級重點實驗室保藏。

1.2 試驗方法

1.2.1 供試品的制備

連翹、茵陳、黃芩分別于60 ℃下烘干后粉碎，過120 目篩，置于棕色瓶中備用。

1.2.2 提取工藝單因素試驗

預試驗結果表明，影響連翹、黃芩和茵陳醇提物（抑菌、抗氧化） 的主要因素為料液比、提取溫度、乙醇體積分數和提取時間，分別選取6 個料液比水平（1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30）、6 個溫度水平（45，55，65，75，85，95 ℃）、6 個乙醇體積分數（25%，35%，45%，55%，65%，75%） 和6 個時間水平（1，2，3，4，5，6 h），通過單因素試驗得到醇提物抑菌和抗氧化活性較好的相關工藝參數。

1.2.3 響應面法優化連翹、黃芩和茵陳提取工藝試驗

在單因素試驗的基礎上，將連翹、黃芩和茵陳提取工藝對沙門氏菌抑菌活性能力影響較顯著的4 個因素料液比（X1）、提取溫度（X2）、乙醇體積分數（X3）、提取時間（X4） 進行優化。根據Boxbehnken 的組合設計原理，用Design Expert 8.0.6 軟件設計四因素三水平，中心點重復3 次試驗，進行Box-behnken 響應面分析試驗。

1.2.4 連翹、黃芩和茵陳醇提物的提取工藝流程

精確稱取連翹2 g，黃芩4 g，茵陳4 g，置于具塞錐形瓶中（單因素試驗結合正交試驗考查確定連翹、黃芩和茵陳復配效果最佳比例為1∶2∶2）。提取液按比例，于功率80 W，40 kHz 下超聲提取35 min后，以不同乙醇體積分數、料液比、提取時間、提取溫度進行提取試驗。然后于4 ℃條件下，以轉速10 000 r/min 離心10 min，取上清液，過濾減壓濃縮濾液至1 g/mL，獲得復配醇提物樣品。

1.2.5 連翹、黃芩和茵陳復合涂膜劑的制備

準確稱量優化脫色后的復配連翹、黃芩和茵陳醇提物的凍干粉1.25 g 于燒杯中，加入97 mL 蒸餾水，置于磁力攪拌器加熱攪拌均勻；緩慢加入2 mL甘油，1 mL 吐溫80，攪拌5 min；加入1 g 可溶性淀粉到成膜劑中，于90 ℃水浴中攪拌30 min 后，放入冰箱4 ℃冷藏備用。

1.2.6 抑菌與抗氧化雙活性檢測

（1） 培養基制備與菌種活化。BPA 培養基、LB培養基、PDA 培養基配方均參考盧圣棟《現代分子生物學實驗技術》第二版。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌、綠膿桿菌、酵母菌、痤瘡丙酸桿菌、曲霉、意大利青霉菌、指狀青霉等分別采用相應培養基復蘇備用。

（2） 復配提取物抑菌活性的測定。將活化好的細菌及酵母菌菌株分別取1 mL 接種至裝有200 mL的相應液體培養基中，振蕩培養。在帶孔混菌平板中按順序加入200 μL 復配醇提物、200 μL 相應乙醇體積分數作為陰性對照，200 μL 相應濃度的尼泊金甲脂醇溶液作為陽性對照，每組設3 個平行，平板于相應溫度恒溫培養12~24 h，電子游標卡尺測量抑菌圈直徑，記錄數據。霉菌抑菌率測定方法為在盧聲潔等人[10]基礎上改進后取1 mL 待測液，稀釋至20 mg/mL。按0.05%~7.00%添加量混勻于20 mL 的PDA 固體培養基內，取霉菌菌絲點于培養基中央，于28 ℃條件下恒溫培養18 h，測量菌落直徑。

（3） 復配醇提物的抗氧化測定。DPPH·清除能力測定方法在Zhang Y F 等人、葛水蓮等人[12-13]基礎上改進后為：將提取液進行50 倍稀釋后保存于帶塞試管作為待測液；吸取2.0 mL 待測液，加入0.1 mmol/L DPPH·乙醇溶液4.0 mL，搖勻26 ℃恒溫避光反應30 min，以無水乙醇調零；于波長517 nm 處測定吸光度A1，用無水乙醇代替DPPH·所測值為吸光度A2，用無水乙醇代替待測液所測值為吸光度A0，同時以質量濃度1 mg/mL 維C 溶液作為陽性對照。每個樣品做3 次重復，試驗數據處理采用Q 值檢測。活性計算公式：

1.2.7 鮮豬肉的分割處理及復合涂膜劑保鮮材料的添加

刀具及案板用75%酒精消毒后，置于超凈工作臺紫外殺菌30 min，在超凈臺中取出肉進行切割處理，將肉切成50 g 左右的塊狀，備用。

1.2.8 鮮豬肉的保鮮試驗

（1） 用生理鹽水將復合凍干粉溶液涂膜劑及凍干粉配制成溶液稀釋，質量濃度分別為250，50，1 μg/mL。

（2） 復合涂膜法處理鮮豬肉。將切塊后的豬肉在不同質量濃度的涂膜劑中浸泡15 s，瀝水3~5 min。

（3） 噴涂法處理鮮豬肉。將不同質量濃度的凍干粉溶液在豬肉表面進行噴涂處理，用無菌噴霧瓶在豬肉表面噴灑。

（4） 設置空白對照組（生理鹽水進行處理）。

（5） 將豬肉放置于無菌托盤后用食品級保鮮膜密封，置于4 ℃條件下避光保存。

（6） 分別在第0 天，第1 天，第2 天，第3 天，第4 天，第5 天，第6 天取樣進行pH 值、總揮發性鹽基氮TVB-N 和活菌計數TVC 測定及感官評價。pH 值檢測，根據國家標準GB 5009.237—2016 法對豬肉樣品進行pH 值檢測。總揮發性堿性氮TVB-N檢測，根據國家標準GB 5009.228—2016 法對豬肉樣品進行TVB-N 檢測。活菌計數TVC 檢測，根據國家標準GB 4798.2—2016 法對豬肉樣品進行TVC檢測。感官評價，根據國家標準GB/T 4798.2—2016法對豬肉樣品進行感官評價。

1.2.9 數據處理與統計分析

試驗均進行3 次重復操作，所有數據用X±s 表示。采用Origin 8.0、Design Expert 8.0.6 等軟件對數據進行處理與分析。

2 結果與分析

2.1 提取工藝優化試驗結果

2.1.1 響應面試驗結果分析響應面試驗分析因素與水平設計見表1。

表1 響應面試驗分析因素與水平設計

使用Design Expert 8.0.6.1 版本中的Box-behnken程序設計四因素三水平的RSM 試驗對提取條件進行優化，并將各變量的水平轉化成編碼制。使用了Design Expert 8.0.6.1 軟件中的ANOVA 功能對響應值進行回歸分析，建立響應面回歸模型，得到回歸方程：

通過軟件中的Optimization 程序優化預測得到最適料液比1∶15.57，提取溫度65.45 ℃，乙醇體積分數65.26%，提取時間2.24 h，在這個最優條件下得到抑菌圈為23.731 6 mm。為方便試驗，選用料液比1∶15，提取溫度65 ℃，乙醇體積分數65%，提取時間2.5 h 進行驗證。通過3 次驗證試驗，得到抑菌圈大小為24.05 mm，與預測值非常接近，說明響應面優化得到的條件準確、可信，按照模型進行試驗準確可行。

料液比、提取溫度、乙醇體積分數及提取時間交互作用對抑菌率的響應面及等高線見圖1。

圖1 料液比、提取溫度、乙醇體積分數及提取時間交互作用對抑菌率的響應面及等高線

由圖1 可知，響應曲面坡度越峭，表明響應值對于試驗中條件的變化敏感，中心在考查區域內，說明考查區域范圍內存在最大響應值。

此外響應面因素對抑菌效果與對總抗氧化能力影響為提取時間（D） >提取溫度（B） > 料液比（A） >乙醇體積分數（C）。

2.1.2 復配醇提物與單獨的連翹、黃芩和茵陳提取物的抑菌活性的比較

連翹、黃芩和茵陳與連翹、黃芩和茵陳醇提物的抑菌活性的比較見表2。

表2 連翹、黃芩和茵陳與連翹、黃芩和茵陳醇提物的抑菌活性的比較

由表2 可知，復配后醇提物的抑菌活性比單獨藥物提取物的抑菌活性有所提高，試驗組對酵母菌、霉菌的抑菌效果均優于沙門氏菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌，說明連翹、黃芩和茵陳醇提物對真菌的抑菌效果可能優于細菌，而對革蘭氏陽性菌的抑菌效果接近革蘭氏陰性菌。

2.1.3 復配醇提物與單獨的連翹、黃芩和茵陳提取物的抗氧化能力對比

連翹、黃芩和茵陳的抗氧化性能見表3。

表3 連翹、黃芩和茵陳的抗氧化性能

由表3 可知，連翹、黃芩和茵陳復配后的抗氧化性能有較大提升，復配液和維C 溶液對DPPH 自由基清除率分別為96.10%和97.55%，清除能力接近。

2.2 豬肉保鮮試驗結果

2.2.1 活菌計數檢測結果

不同質量濃度的凍干復溶制劑對鮮豬肉TVC 含量的影見圖2。

圖2 不同質量濃度的凍干復溶制劑對鮮豬肉TVC 含量的影響

新鮮肉的活菌數應小于104CFU/g，次鮮肉為104~106CFU/g，變質肉大于106CFU/g[15]。由圖2 可知，噴涂法和涂膜劑法處理的豬肉的保鮮期均延長了2 d。說明在活菌數層面上涂膜劑法和噴涂法的保鮮效果基本相同。

2.2.2 總揮發性鹽基氮（TVB-N） 檢測結果

不同質量濃度的凍干復溶制劑對鮮豬肉TVB-N的影響見圖3。

圖3 不同質量濃度的凍干復溶制劑對鮮豬肉TVB-N 的影響

新鮮肉的TVB-N 應小于1.5 mg/g，次鮮肉小于0.2 mg/g，變質肉大于0.2 mg/g[15]，由圖3 可知，噴涂法處理的豬肉保鮮期延長了2 d，涂膜劑法處理的豬肉保鮮期均延長了3 d，說明在TVB-N 層面上，對于鮮豬肉來說，涂膜劑法的保鮮效果更好。

2.2.3 pH 值檢測結果

不同質量濃度的凍干復溶制劑對鮮豬肉pH 值的影響見圖4。

圖4 不同質量濃度的凍干復溶制劑對鮮豬肉pH 值的影響

新鮮肉的pH 值為5.8~6.2，次鮮肉為6.3~6.6，變質肉大于6.7[15]。由圖4 可知，涂膜劑法處理的豬肉保鮮期均延長了3 d，噴涂法處理的豬肉保鮮期均延長了2 d，說明在pH 值層面上噴涂法處理的豬肉保鮮效果稍微弱。

2.2.4 感官評價結果

不同質量濃度的凍干復溶制處理豬肉第3 天時的感官評價見表4。

表4 不同質量濃度的凍干復溶制處理豬肉第3 天時的感官評價

根據國家標準GB/T 4798.2—2016，常溫避光保存的空白組豬肉在第2 天前后變質，選取第3 天時對豬肉進行感官評價。根據表4 的評分標準對其進行感官評價。由表4 可知，涂膜劑法處理的豬肉評分高，說明從感官上看，涂膜劑法處理的豬肉保鮮效果更好。

3 結論

化學類防腐劑長期使用，不但會增加微生物的耐藥性，同時劑量的使用還會帶來極大安全隱患。秦桂芳等人[16]通過測定10 種中藥、2 種方劑及復配制劑，發現復配藥物的拮抗效果明顯高于單獨方劑，說明復配抑菌劑對致病菌抗菌作用更強。茍軍麗等人[17]通過網絡藥理學的工具和方法，探究甘草-石榴皮復配效果，也證明了復配藥物的優勢。Li W H 等人[18]也進一步證明了復方中藥創新利用的可行性與前景。黃芩浸提液是中醫臨床上常用的外用擦劑，藥理活性廣泛，具有多種功效，復配藥物連翹、茵陳有利于提高抑菌活性和抗氧化活性，為用作防腐劑提供理論與數據支撐。采用單因素試驗結合響應面設計的方法，得到復配物的最佳醇提條件：料液比1∶15，提取溫度65 ℃，乙醇體積分數65%，提取時間2.5 h。復配物的抑菌活性和抗氧化活性與單獨的各成分相比均有所提高，經復配涂膜劑處理后的鮮豬肉可延長保鮮期2~3 d。因此，通過連翹復配黃芩、茵陳涂膜劑藥物協同發揮作用可作為食品中的優良的雙活性天然防腐劑應用于食品防腐中。