中藥活性成分通過調節m6A 甲基化修飾抗腫瘤的研究進展

韓 笑，王夢斐，蒲位凌，劉 博，于海洋*

1.天津中醫藥大學組分中藥國家重點實驗室 天津 301617

2.四川大學生物治療國家重點實驗室 四川 成都 610041

隨著醫學的進步和對腫瘤認識的加深，腫瘤治療可以選用多種不同的方式，包括放療、化療、手術和免疫治療等。目前癌癥治療中手術仍不失為一線治療方案，但癌癥手術治療存在風險性，尤其是對于部位敏感的腫瘤，如腦腫瘤，手術危險性大，成功率低。另外，癌癥手術對人體創傷大，使患者免疫力降低，對疾病抵抗能力下降，術后易產生一系列手術并發癥。此外，化療和放療治療后易引起患者抑郁、食欲不振等副作用的發生。近年來，來自傳統中藥（traditional Chinese medicine，TCM）中活性成分在腫瘤治療中的潛力已被西方國家所認可。已有多種天然產物及其衍生物被納入癌癥化療的標準庫，例如長春花生物堿、紫杉醇和喜樹堿等[1]。目前，傳統中藥對腫瘤的治療效果得到證實，但其治療癌癥的機制仍有許多尚不明確，限制了其臨床使用。因此，作為癌癥的新型或替代療法需對其作用機制進行深入研究[2]。

表觀遺傳學是指在不改變DNA 序列的基礎上調節基因發生可遺傳變化的一門學科，包括DNA 甲基化、RNA 甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA 調控等[3-6]。其中，DNA 和RNA 的甲基化修飾普遍影響多種疾病進程，在近期研究中被廣泛關注[7]。N6-腺苷酸甲基化（N6-methyladenosine，m6A）是迄今為止最普遍最豐富的RNA 甲基化修飾，是指RNA腺苷酸的第6 位氮被甲基化，隨著特異性抗體的研發及高通量測序的快速發展，幾乎所有類型的RNA上均發現m6A 修飾[8]。1997 年第1 個m6A 甲基轉移酶樣蛋白3（methyltransferase like 3，METTL3）的成功克隆[9]以及2011 年第1 個m6A 去甲基化酶肥胖相關蛋白（fat mass and obesity-associated protein，FTO）的確定，表明m6A 甲基化修飾是動態可逆的，這為表觀遺傳學的研究注入了新的生機[10]。已有研究表明，m6A 修飾相關蛋白及m6A修飾的失調在腫瘤發生發展中起著至關重要的作用。本文旨在介紹m6A 修飾相關蛋白的分類及功能，并總結中藥活性成分通過調節m6A 甲基化修飾發揮抗腫瘤作用的研究進展。

1 m6A 甲基化酶的分類及功能

1.1 m6A 甲基轉移酶

甲基化轉移酶（methyltransferase）也稱“Writers”，是指催化 RNA 上的特定堿基序列（RRACH，其中R = G/A，H = A/C/U）發生m6A甲基化修飾的酶。由核心蛋白METTL3、METTL14、WTAP、RBM15、RBM15B、HAKAI、VIRMA（KIAA1429）和ZC3H13 組成的甲基轉移酶復合物催化[11]。METTL3 和METTL14 在核斑點中共定位形成異二聚體復合物（MTC）。其中METTL3 是通過S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）作為甲基供體催化甲基化的發生，選擇性誘導RNA的GAC 和AAC 堿基序列發生甲基化。越來越多的研究表明，METTL3 參與腫瘤的生長、侵襲、遷移等多個方面[12]。例如，METTL3 可通過m6A/YTHDF2 依賴的方式抑制肝細胞癌中細胞因子信號傳導抑制因子 2（suppressor of cytokine signaling 2，SOCS2）的表達，使其在功能上被沉默，從而促進HCC 細胞的增殖與遷移[13]；METTL3 還可通過調節靶基因和通路介導結直腸癌的發生發展，從而引發結直腸癌細胞的自我更新、增殖和遷移等[14]。與METTL3 相比，METTL14 在大多數的癌種中起到抑癌作用，包括肝癌、膀胱癌、子宮內膜癌、膠質母細胞瘤、腎細胞癌、胃癌、結直腸癌等[15]。功能上METTL14 選擇性誘導RNA 的GAC堿基序列甲基化[16]。除此之外，其他蛋白缺乏RNA甲基化酶活性。WTAP 作為m6A 甲基轉移酶的調節亞基，與METTL3 和METTL14 相互作用并將其募集到核斑點[17]。最近的研究表明，WTAP 的異常表達與癌癥中的多種現象密切相關，包括細胞周期、代謝、自噬、免疫、鐵死亡、上皮間充質轉化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）和耐藥性等[18]。RBM15 和RBM15B 結合METTL3 和WTAP，并將其精準定向到m6A 修飾后的RNA 位點上[19]，目前已在多項腫瘤研究中檢測到RBM15的異常突變，包括間質性甲狀腺癌[20]、急性髓系白血病[21]及肺癌[22]等。VIRMA 通過募集MTC 來調節區域選擇性甲基化的發生，主要在3’UTR 和終止密碼子附近介導m6A 修飾[23]，VIRMA 以m6A 依賴的方式，通過靶向DNA 結合抑制因子2（inhibitor of DNA binding 2，ID2）、GATA 結合蛋白3（GATA binding protein 3，GATA3）、細胞周期蛋白依賴性激酶1（cyclin-dependent kinase 1，CDK1）等調節不同通路發揮促癌作用[24]。ZC3H13、WTAP 及CBLL1等多種輔助因子的共同作用，可有效地調控核內m6A 甲基化修飾[19,23]。此外，最近研究人員提出，存在獨立的RNA 甲基轉移酶METTL16，可調控細胞內SAM水平并參與U6核內小RNA（small nuclear RNA，snRNA）中的m6A 修飾[25]。

1.2 m6A 去甲基化酶

去甲基化酶（demethylases）也稱“Erasers”，m6A去甲基化酶FTO[10]及alkB同系物5（ALKBH5）的發現，表明m6A 修飾過程的可逆性。ALKBH5 與FTO 均為Alkb 家族的同源蛋白，以α-酮戊二酸和二價鐵離子依賴的方式催化m6A 修飾的腺苷去甲基化[26]，FTO 或ALKBH5 的表達與細胞中的m6A整體含量密切相關。其去甲基化的過程大致為氧化m6A 形成N6- 羥甲基腺苷（N6-hydroxymethyladenosine，hm6A），然后將hm6A 轉化為中間體N6-甲酰腺苷（N6-formyladenosine，f6A），最后f6A 水解為腺苷（A）。FTO 主要表達在大腦，可以調節脂肪產生和機體能量穩態[27]。FTO 在癌癥中的作用在黑色素瘤中首次得到證實[28]。除此之外，FTO在不同癌種中功能及對腫瘤進展的影響也相繼被證實。ALKBH5 在睪丸中的表達最高，在心臟和大腦中的表達相對較低，主要影響核RNA 的轉運及基因表達[29]。研究表明ALKBH5 可通過調節FOXM1 的表達，增強了膠質母細胞瘤干細胞的自我更新和增殖，并促進腫瘤的發生[30]。此外，ALKBH5 是多種癌癥的預后指標，其可以調節腫瘤生物過程，如細胞增殖、侵襲、遷移、轉移和腫瘤微環境等[31]。最近的研究確定了另一種m6A 去甲基化酶AlkB 同系物3（ALKBH3），且發現其多選擇性介導tRNA 而非mRNA 或rRNA 中的m6A 修飾，同樣可以通過上述機制完成去甲基化過程[32]。

1.3 m6A 甲基化閱讀蛋白

甲基化閱讀蛋白（RNA N6-methyladenosine reader）又稱“Readers”。m6A 閱讀蛋白可以通過識別并結合甲基轉移酶修飾的RNA 序列來調節該基因的表達，進而影響其下游生物學功能。不同的閱讀蛋白具有不同的m6A 定位功能，包括YTH 結構域蛋白家族 YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1 和YTHDC2，其具有保守的m6A 結合結構域，可以與含有m6A 修飾的RNA 結合[33]。其中，YTHDC1 位于細胞核，主要參與編碼RNA 的剪接和非編碼RNA 介導的基因沉默，影響RNA 出核等功能[34]，其在癌細胞增殖、血管生成、轉移等多種細胞功能中至關重要[35]。其他4 個蛋白均在細胞質中發揮功能，YTHDC2 結合于甲基化修飾的mRNA序列上提高其翻譯效率[36]，在腫瘤發生發展中YTHDC2 是誘導惡性表型的蛋白質翻譯所必需的。YTHDF1 與終止密碼子周圍的m6A 位點結合，提高被修飾RNA 的翻譯效率[37]；YTHDF2 能夠特異性識別經m6A 修飾的mRNA，招募相應的酶破壞靶RNA 穩定性、促進其降解[38]；YTHDF3 既可與YTHDF1 協同作用促進靶RNA 翻譯，同時還可以通過直接與YTHDF2 相互作用來加速mRNA 降解[39]。YTHDF 蛋白可以作為致癌因子促進癌癥的發生發展，同時也可以作為腫瘤抑制因子來抑制某些癌癥發生[40]。除了YTH 結構域家族的成員外，還有其他的m6A 甲基化閱讀蛋白，包括核內不均一性核糖核蛋白（HNRNP）家族成員HNRNPA2/B1、HNRNPC 和HNRNPG，胰島素樣生長因子2 mRNA結合蛋白（IGF2BP）家族成員IGF2BP1/2/3 以及真核起始因子3（eukaryotic initiation factor 3，eIF3）。HNRNPA2/B1 可以識別前體 microRNA（primiRNA）上的m6A 修飾位點，促進pri-miRNA 加工[41]；HNRNPC 和HNRNPG 在識別m6A 后可通過調節mRNA 豐度和剪接進而影響RNA 的二級結構[42]。IGF2BP1/2/3 可識別并以m6A 依賴方式促進mRNA 穩定性和翻譯并參與mRNA 的剪切[43]。elF3在甲基化修飾過程中可與YTHDF1 相互作用，與RNA 5’UTR 上被修飾的堿基序列結合促進mRNA的翻譯[44]。由于不同組織的腫瘤基因表達譜有一定差異，m6A 修飾相關蛋白在不同腫瘤中的作用和機制也大不相同。近年來的研究表明，m6A 修飾在腫瘤發生發展中起著關鍵作用，m6A 修飾相關蛋白已被驗證為多種癌癥的潛在生物標志物。以調控腫瘤中RNA 的m6A 修飾水平為靶點，研發天然、低毒及高效的靶向抗腫瘤藥物，可能為腫瘤的預防和治療提供新的研究方向。

2 中藥活性成分通過調節m6A 甲基化修飾發揮抗腫瘤的作用

2.1 中藥活性成分通過調節m6A 甲基轉移酶抗腫瘤

METTL3 作為m6A 甲基轉移酶，通過與SAM結合將甲基基團轉移到被修飾的RNA 上形成甲基化RNA。已有研究表明METTL3 在不同類型的癌癥中表達水平各異且發揮不同的功能。金雀異黃酮可通過直接抑制METTL3 的表達影響其催化活性，進而下調整合素 Β1（integrin beta-1，ITGB1）mRNA 上m6A 水平，抑制ITGB1 表達，進而在抑制細胞遷移、侵襲等過程中發揮作用，達到抑制肺腺癌進展的目的[45]；槲皮素作為一種多功能抗氧化劑，可降低心血管疾病、代謝紊亂和各種癌癥帶來的危害[46]，現有研究表明槲皮素可通過下調基質金屬蛋白酶 2 （ matrix metalloproteinase-2，MMP2）、埃茲蛋白（Ezrin）、P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）和METTL3 表達增強宮頸癌細胞的化學敏感性進而達到加強順鉑抗腫瘤作用的目的，最終促進宮頸癌細胞凋亡[47]；此外，虛擬篩選研究結果表明槲皮素可以與METTL3蛋白結合，形成穩定的蛋白質-配體復合物，作為METTL3 抑制劑抑制腫瘤細胞增殖[48]。龍血竭作為一種傳統草藥，傳統用于治療心血管、胃腸道、婦科等疾病，近年在癌癥研究中取得一定的進展。研究表明龍血竭乙醇提取物能通過下調METTL3 表達并降低METTL3 和凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis，IAP）家族的成員生存素（survivin）mRNA的結合，來降低survivin mRNA 中的m6A 修飾以減少其表達，最終通過促進細胞凋亡發揮抗肝癌作用，且龍血竭能有效抑制裸鼠肝癌異種移植的生長，呈現出毒性低，不良反應小的特點[49]。黃芩苷是一種黃酮類化合物，主要來源于黃芩。研究表明黃芩苷通過作用于METTL3，下調己糖激酶結構域蛋白1（hexokinase domain component 1，HKDC1）的甲基化含量使 HKDC1 表達下調，最終通過影響HKDC1/JAK2/STAT1/caspase-3 通路誘導肝細胞凋亡，抑制2 型糖尿病誘發的肝癌發生發展，這為黃芩苷用于預防和治療二型糖尿病誘導的肝癌臨床應用提供了理論依據[50]。

METTL14 作為“Writers”的另一重要成員，是許多癌癥的腫瘤抑制因子，包括結直腸癌[51]，膀胱癌[52]和乳腺癌[53]等。異丹葉大黃素（isorhapontigenin，ISO）是從少苞買麻藤中提取得來，被證明具有抗癌特性。研究發現ISO 可通過下調波形蛋白（vimentin，Vim）的表達來抑制膀胱癌細胞的侵襲，作用機制為ISO 處理后上調轉錄因子FOXO3a 的表達并激活METTL14，METTL14 下調EMT 家族中的關鍵成員Vim 的表達進而抑制膀胱癌細胞的侵襲[54]。Delicaflavone（DLL）是主要來源于中藥石上柏的雙黃酮類化合物，研究表明其具有抗腫瘤活性。最新研究表明DLL 通過抑制肺癌細胞中的METTL3 和METTL14 來上調STAT1 和干擾素調節因子1（interferon regulatory factor 1，IRF1）的表達以及細胞因子的分泌，激活抗腫瘤免疫來抑制肺癌細胞生長[55]。

2.2 中藥活性成分通過調節m6A 去甲基化酶抗腫瘤

FTO 作為一種m6A 去甲基轉移酶，最初發現在肥胖相關疾病中發揮作用，近年研究表明FTO 也以m6A 依賴的方式影響腫瘤的發展，且在多數癌種中均表達升高[56-57]。研究發現，溫郁金提取物欖香烯對結直腸癌5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）耐藥性有一定程度的改善作用，實驗結果表明FTO通過p53/GPX4 通路調控鐵死亡，并參與β-欖香烯逆轉結直腸癌5-FU 耐藥的過程[58]。FTO 作為關鍵蛋白在白血病的發生以及白血病細胞分化中同樣起著重要作用[59]，天然的蒽醌衍生物大黃酸，作為FTO 的抑制劑可以降低其細胞內FTO 蛋白的表達水平，誘導M3 型急性髓系白血病細胞HL-60、NB4及急性淋巴細胞Nalm6 發生凋亡[60]。檳榔堿是檳榔中的主要活性生物堿，是口腔黏膜下纖維化和口腔癌發展的強效致癌物，研究表明這可能與檳榔堿上調FTO 的表達促進體內外口腔癌細胞的增殖與遷移能力有關[61]。從柴胡中提取的一種三萜皂苷化合物柴胡皂苷-D 可通過直接靶向FTO，參與FTO介導的m6A 甲基化修飾調控其下游靶標MYC、CEBPA、ASB2、RARA 的表達抑制白血病細胞增殖[62]。另有研究表明，中藥黃連中提取的異喹啉類生物堿小檗堿，可通過降低FTO 負調節因子β 連環蛋白的表達而上調FTO 的蛋白表達水平，降低m6A 的總RNA 修飾達到調節腫瘤干細胞干性的目的，該研究結果表明小檗堿可能作為一種新型m6A 甲基化調節劑在結腸癌的治療中發揮作用[63]。賴巍巍等[64]秉持著“老藥新機制”的原則從表觀遺傳調控方面揭示黃芩苷抗腫瘤效應的表觀干預機制，發現黃芩苷能夠上調m6A 甲基轉移酶METTL3 和METTL14 的表達且下調去甲基轉移酶FTO 和ALKBH5 的表達，上調m6A 甲基化修飾進而調控Suv39H1基因的選擇性剪切發揮抗鼻咽癌的作用。

2.3 中藥活性成分通過調節m6A 甲基化閱讀蛋白發揮抗腫瘤作用

m6A 甲基化閱讀蛋白主要功能為識別并結合甲基轉移酶修飾后RNA 的m6A 位點，進而決定靶RNA 的不同去向及生物學功能。最近研究表明，漆黃素可通過下調甲基轉移酶ZC3H13 的表達，降低參與DNA 損傷的PHD 指蛋白10（PHD finger protein 10，PHF10）的m6A 修飾，使YTHDF1 識別修飾后的PHF10 并穩定其表達的功能被抑制，誘導DNA 損傷進而發揮抗胰腺癌的作用[65]。白藜蘆醇作為一種含芪類結構的多酚類非黃酮天然活性物質，來源廣泛且具有多種生物學功能。研究表明白藜蘆醇可通過降低YTHDF2 表達水平和m6A整體含量進而調控人肝癌細胞HepG2 的脂質代謝和能量代謝，抑制肝癌細胞的增殖能力[66]。中藥雷公藤中存在的一種重要的天然生物活性物質雷公藤紅素，可通過下調胰腺癌細胞中的METTL3 而降低細胞中總體RNA m6A 修飾水平，尤其是下調扣環基因（claspin，CLSPN）和B 細胞淋巴瘤-2（Bcell lymphoma-2，Bcl-2）的mRNA m6A 的修飾水平；同時可通過下調細胞中YTHDF3，降低Claspin和Bcl-2的mRNA 的穩定性而影響其表達水平，抑制胰腺癌細胞的增殖和細胞周期進程、促進細胞凋亡[67]。人參皂苷Rh2是紅參中特有的皂苷成分，具有廣泛的抗腫瘤效果，研究表明人參皂苷Rh2可通過下調驅動蛋白家族成員KIF26B（kinesin family member 26B，KIF26B）表達進而影響甲基轉移酶ZC3H13/CBLL1 的核定位，降低其對致癌因子SRF的m6A 修飾，使m6A 甲基化閱讀蛋白IGFBP1 與m6A 修飾后SRF mRNA 上3’UTR 結合減少，最終通過破壞SRF 的穩定性、減少其表達達到抑制腫瘤細胞生長的目的[68]；此外，黃連中黃連堿被證明可通過促進IGF2BP1 泛素化抑制肝細胞癌增殖和轉移[69]。鉤吻中主要毒性成分胡蔓藤堿乙，可顯著下調m6A 識別蛋白IGF2BP3 的表達，導致其靶向的細胞骨架、緊密連接和粘附連接相關基因的存儲、翻譯和降解發生紊亂，揭示了胡蔓藤堿乙誘導人結腸癌細胞HCT116 細胞毒性的潛在分子機制[70]。

3 結語與展望

m6A 甲基化作為最普遍的RNA 修飾在腫瘤發展中具有兩面性，某些基因的m6A 修飾增多可能調節該基因的表達水平、介導其功能的改變進而影響腫瘤發展，而一些基因缺乏m6A 修飾也可能促進或抑制腫瘤的發展。同時m6A 修飾相關蛋白作為多種生理過程和疾病進展的關鍵蛋白，在腫瘤的發展中同樣發揮著重要作用。總之，m6A RNA 甲基化研究方法的快速發展及m6A 與癌癥之間機制的深入挖掘有助于揭示癌癥發展的潛在機制[71]。

中藥是自然界的饋贈，與化學藥物的臨床治療療效相比，這些來自草藥的活性成分在具有療效的基礎上擁有相對較低的毒性。有證據表明，中醫藥聯合化療或放療能夠在增強其療效的同時減少由放、化療引起的不良反應。已有大量研究闡明了中藥在癌癥治療中的作用機制[72]。本文綜述了m6A 修飾相關蛋白的分類和功能，以及中藥有效成分如金雀異黃酮、槲皮素、龍血竭提取物、黃芩苷、白藜蘆醇、人參皂苷Rh2等直接調節m6A 修飾相關蛋白或以m6A 依賴的方式調節相關通路發揮抗腫瘤作用的研究進展（表1、圖1）。本文旨在更清楚地闡述中藥活性成分用于癌癥治療的分子機制，為拓寬中藥應用范圍、開發其抗癌潛力，以及為傳統中藥臨床轉化提供理論基礎。為挖掘更多的中藥活性成分及其抗癌的潛在機制提供思路。

圖1 不同中藥活性成分對m6A 甲基化修飾的調節機制Fig.1 Regulatory mechanism of m6A methylation modification by different active ingredients of traditional Chinese medicine

表1 抗腫瘤的中藥有效成分及其作用的酶Table 1 Anti-tumor active ingredients of traditional Chinese medicine and their effects on enzymes

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突