基于HS-GC-MS 和電子感官技術比較不同產地金銀花氣味和味道差異

馬涵玉，錢 琪,2,3，王鳳霞，周英森，賈振華，孫 帥，牛麗穎,2,3*

1.河北中醫藥大學，河北 石家莊 050091

2.河北省中藥配方顆粒技術創新中心，河北 石家莊 050091

3.中藥材品質評價與標準化河北省工程研究中心，河北 石家莊 050091

4.河北省科學院，河北 石家莊 050052

金銀花又稱忍冬藤花，甘，寒，為忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花[1]。金銀花在全國各省都有分布，但主要集中于河北、河南、山東等地[2]。不同產地物候條件下采收的金銀花質量存在顯著差異，其揮發性成分的種類受氣候、土壤等條件的影響[3-4]，而多種揮發性成分作用是使金銀花擁有“清香”氣和“味淡、微苦”[1]性質的關鍵因素之一，揮發性成分的差異會引起氣味和味道的變化，故對不同產地金銀花的氣味和味道進行量化分析對金銀花的產地鑒別有重要意義。目前對不同產地金銀花的研究多集中于其所含化學成分種類和含量的測定[5]，而明確不同產地間感官特征和化學成分的差異可為金銀花的產地區分提供新的思路與策略。

因此本研究采用HS-GC-MS、電子鼻和電子舌技術對不同產地金銀花的揮發性成分、氣味和味道及進行研究。通過與質譜庫進行比對鑒定揮發性成分，通過電子鼻和電子舌傳感器的響應值來確定氣味和味道，并結合主成分分析（principal component analysis，PCA）及正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）進行分析，尋找河北、河南、山東產地金銀花揮發性成分、氣味和味道的差異，以期為金銀花的產地鑒別及質量評價提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

TQ8050 NX 型氣相色譜-質譜聯用系統（日本島津公司）；PEN3 型電子鼻系統（德國AIRSENSE 公司）；SA402B 型電子舌系統（日本Insent 公司）；BSA224S-CW 型電子分析天平（北京賽多利斯有限公司）；KQ-250 型超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）；TDZ5-WS 型低速離心機湘儀實驗儀器開發公司（湖南湘儀實驗儀器開發有限公司）；純化水來自UPR-II-20L 凈水系統（四川純技術公司）。

1.2 材料

41 批金銀花樣品取自于河南、山東、河北，詳細信息見表1，經河北省藥品醫療器械檢驗研究院段吉平中藥師鑒定為忍冬科植物忍冬L.japonicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花。

表1 金銀花樣品信息Table 1 Lonicerae Japonicae Flos sample information

2 方法與結果

2.1 HS-GC-MS 分析

2.1.1 樣品前處理 金銀花樣本粉碎，過40 目篩，稱取1.0 g 于20 mL 螺口頂空瓶中，聚四氟乙烯隔墊密封。進樣方式：頂空進樣；樣品加熱溫度80 ℃；加熱時間15 min；進樣量1 000 μL。

2.1.2 氣相色譜條件 色譜柱：SH-I-5 Sil MS 型毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口250 ℃；載氣氦氣；載氣控制方式：恒線速度控制，83.5 kPa；分流比9∶1；程序升溫初始40 ℃，維持2 min，5 ℃/min 升至220 ℃，維持1 min。

2.1.3 質譜條件 離子源溫度200 ℃；接口溫度250 ℃；電離方式為電子轟擊電離源（EI），溶劑延遲時間2 min；檢測器電壓：相對于調諧結果，0.3 kV；采集時間：3～39 min；采集方式：Q3 Scan；掃描范圍m/z50～600。使用質譜庫（NIST20）檢索，并進行人工比對和解析，結合相似度和保留時間確定化合物。

2.1.4 數據處理 HS-GC-MS 檢測結果的鑒定采用NIST20 標準質譜圖庫檢索（相似度≥85%）并結合參考相關文獻。使用MSDIAL ver.4.80 軟件進行峰的解卷積和峰面積的歸一化。利用SIMCA 14.0 軟件對共有成分做OPLS-DA 分析篩選變量投影重要性（variable importance projection，VIP）值＞1 的潛在差異成分。

2.2 電子鼻分析

采用直接頂空進樣法進行測定。稱取金銀花供試品粉末1.0 g，置于100 mL 燒杯中，使藥材粉末平鋪于燒杯底部，雙層封口膜封口，室溫靜置30 min，上機測試。采樣間隔1 s，清洗60 s，零點調整10 s，預采樣5 s，測試120 s，進樣體積流量300 mL/min。每批金銀花稱量3 份，平行測定3 次，取平均值進行數據分析。電子鼻各傳感器詳細信息見表2。

表2 電子鼻傳感器陣列性能Table 2 Array performance of electronic nose sensor

2.3 電子舌分析

稱取金銀花供試品粉末1.0 g，置于100 mL 錐形瓶中，加入100 mL 純凈水，超聲提取10 min 后，轉速4 000 r/min 離心5 min，取上清液于電子舌專用樣品杯中上機測試。將原始數據在電子舌自帶數據處理軟件中轉化為味覺值后導出進行分析。電子舌各傳感器詳細信息見表3。

表3 電子舌傳感器陣列性能Table 3 Array performance of electronic tongue sensor

2.4 不同產地金銀花樣品的HS-GC-MS 分析

2.4.1 總體差異分析 采用HS-GC-MS 測定3 個產地金銀花樣品的揮發性成分，以HB-1、HN-1、SD-1樣品為例，總離子流圖見圖1。如圖2 進行PCA（PC1: 0.392，PC2: 0.175），可以看出3 個產地的金銀花樣品各聚為一群，河北和山東地區的金銀花揮發性成分較相似，與河南地區揮發性成分差異較大。從3 個產地中共鑒定出揮發性成分73 種（表4），其中共有成分26 個。

圖1 金銀花揮發性成分總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram of volatile components of Lonicerae Japonicae Flos

圖2 不同產地金銀花PCA 得分圖Fig.2 PCA score plot of Lonicerae Japonicae Flos from different producing areas

表4 不同產地金銀花揮發性成分鑒定結果Table 4 Results of volatile components of Lonicerae Japonicae Flos from different producing areas

2.4.2 差異揮發性成分篩選 將金銀花樣品所有揮發性成分整合后導入SIMCA-P 14.1 軟件進行OPLS-DA，主成分特征值及方差貢獻率見表5。為了確定哪些揮發性成分的含量差異在區分不同產地金銀花上起了重要作用，以VIP＞1、雙尾t檢驗有統計學意義（P＜0.05）為標準篩選河南與河北、河南與山東、河北與山東的金銀花的差異揮發性成分，對每個OPLS-DA 模型進行了200 次置換檢驗，結果說明各模型穩定性及預測能力較好，具有顯著統計學意義，見圖3 和表5。

圖3 OPLS-DA 得分圖 (A) 和OPLS-DA 模型的置換檢驗圖 (B)Fig.3 OPLS-DA score plot (A) and Permutation test plot of OPLS-DA model (B)

表5 金銀花樣品多元統計分析數據Table 5 Multivariate statistical analysis data of Lonicerae Japonicae Flos samples

從河南與河北已鑒定的共有成分中篩選出符合標準的成分15 個，分別為6-甲基-1-庚醇、(E)-2-戊烯醛、己醛、戊酸甲酯、4-己烯-1-醇乙酸酯、1-己醇、庚醛、己酸甲酯、苯甲醛、辛醛、(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮、1-辛醇、壬醛、丁香醛（異構體）、萘；從河南與山東已鑒定的共有成分中篩選出符合標準的成分11 個，分別為2-乙基-1-戊醇、己醛、(E)-2-己烯醛、4-己烯-1-醇乙酸酯、1-己醇、庚醛、苯甲醛、2-戊基呋喃、辛醛、壬醛、丁香醛（異構體）；從河北與山東已鑒定的共有成分中篩選出符合標準的成分13 個，分別為2-乙基-1-戊醇、6-甲基-1-庚醇、(E)-2-戊烯醛、1-戊醇、己醛、戊酸甲酯、(E)-2-己烯醛、己酸甲酯、(E)-2-庚醛、2-戊基呋喃、(E,E)-2，4-庚二烯醛、(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮、丁香醛。差異性揮發成分詳細信息見表6。其中3 個產地中含量均有顯著差異的共有差異性揮發成分有2 個，為己醛和丁香醛（異構體）。

表6 差異揮發性成分篩選結果Table 6 Screening results of differential volatile components

2.5 電子鼻結果

對不同產地金銀花各樣本電子鼻傳感器響應值進行數據分析。如圖4-A 進行PCA（PC1: 0.644，PC2: 0.159）分析，河北金銀花可與山東和河南的區分開，山東和河南大致可分開，但是有重疊部分，說明河北金銀花的氣味與山東與河南的不同，而山東與河南金銀花的氣味有相似之處。由雷達圖（圖4-B）可知，傳感器W5S、W1S、W1W、W2W 有明顯響應，即來自這3 個產地的金銀花中含有較多的氮氧化合物、短鏈烷烴、無機硫化物、芳香成分和有機硫化物，這5 類化合物也是造成不同產地金銀花氣味產生差異的重要因素。

圖4 不同產地金銀花電子鼻分析Fig.4 E-nose analysis of Lonicerae Japonicae Flos of different producing areas

由圖4-C 可知，河南金銀花W5S、W1S 和W1W傳感器的響應最高，說明河南金銀花中含有較多的氮氧化合物、短鏈烷烴和無機硫化物；山東金銀花與河南的金銀花W2W 傳感器的響應強度相似，說明兩者中芳香成分和有機硫化物含量相似；河北因金銀花4 個傳感器的響應均最低，說明其氮氧化合物、短鏈烷烴、無機硫化物、芳香成分和有機硫化物含量均較少。

2.6 電子舌結果

以參比溶液的輸出為味覺零點又稱無味點，因參比溶液中含有少量的酸和鹽，故酸味和咸味的無味點分別為?13 和?6，其他無味點均為0。

如圖5-A 對不同產地金銀花各樣本味覺值進行PCA（PC1: 0.468，PC2: 0.254），3 個產地的金銀花樣品各聚為一組，說明電子舌可對不同產地金銀花進行較好的區分且3 個產地金銀花的味道有明顯區別。由雷達圖（圖5-B）可知，3 個產地金銀花均具有明顯的苦味、澀味、鮮味和甜味，這4 種味道也是造成不同產地金銀花味道產生差異的重要原因。由分組差異柱狀圖可知（圖5-C），山東金銀花的苦味、澀味、鮮味較明顯，河南金銀花的澀味、鮮味、甜味較弱，河北金銀花的苦味較弱，山東和河北金銀花的甜味相當。據結果推測山東金銀花各味道較明顯，滋味更濃郁豐富；河北金銀花苦味、澀味較低，甜味較高，更適口；河南金銀花的味道整體較淡。

圖5 不同產地金銀花電子舌分析Fig.5 E-tongue analysis of Lonicerae Japonicae Flos of different producing areas

2.7 不同產地金銀花樣品氣味與化學成分關聯分析

通過電子鼻的結果發現W1C、W5S、W2S 和W1W 是響應較強的傳感器。為了更好地了解電子鼻傳感器與差異揮發性成分之間的關系，使用篩選出的所有差異性揮發成分（共21 個）與電子鼻4 個響應較強的傳感器進行pearson 相關分析。圖中紅色越深，表明正相關越強，即當這些化合物的含量增加時，相應電子鼻傳感器的響應更強，藍色越深則反之。

分析結果表明，4-己烯-1-醇乙酸酯、1-己醇、苯甲醛、辛醛、1-辛醇、壬醛、丁香醛（異構體）、萘與W1C、W5S、W2S 和W1W 的響應值均呈較強正相關。(E)-2-戊烯醛、1-戊醇、戊酸甲酯、乙酸甲酯、(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮與W1C、W5S、W2S 和W1W 的響應值均呈較強負相關。結合電子鼻各傳感器的屬性，確定了區分41 批金銀花氣味差異的物質基礎主要為1-己醇、苯甲醛、辛醛、1-辛醇、壬醛、丁香醛（異構體）、萘、(E)-2-戊烯醛、1-戊醇、(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮（圖6）。

圖6 電子鼻主要響應傳感器與差異揮發性成分的關聯性分析Fig.6 Correlation analysis of main response sensors of Enose with differential volatile components

2.8 不同產地金銀花味道判別分析

為實現對新金銀花樣本產地的預測，使用SPSS25 對35 個金銀花樣本建立判別模型，并對HB3、HB6、HN3、HN9、SD3、SD9 號金銀花樣品的測試結果進行判別驗證。其分類函數分別為Y1＝1.940X1＋2.326X2＋0.676X3－6.983X4＋0.894X5＋5.307X6＋0.459X7－41.033，Y2＝?1.443X1＋1.157X2＋1.447X3－4.367X4＋0.990X5＋1.214X6＋1.193X7－18.940。判別結果顯示（表7），其對河北、河南、山東金銀花能進行有效的判別，判別識別率為100%。

表7 不同產地金銀花分類結果Table 7 Classification results of different Lonicerae Japonicae Flos from different producing areas samples

3 討論

中藥材的品質與產地密切相關，金銀花獨特的“氣”和“味”是其重要特征，對藥材的辨識具有重要的參考價值，且金銀花中含有的多種揮發類成分，是其具有抗菌功能的物質基礎[6]。基于此，本文嘗試從揮發性成分、氣味和味道多個角度結合多元統計分析，探討不同產地的金銀花的差異。

通過HS-GC-MS 分析、OPLS-DA 和單因素方差分析篩選出己醛和丁香醛（異構體）為3 個產地共有的差異揮發性成分，醛類一般具有青香、果香和甜香，可對總體特征風味起產生影響[7]，而己醛和丁香醛均有怡人的果香[8-9]。甜味屬里甜香、花香、果香的增強，可起到掩蓋和弱化苦味的效果[14]。因此可以通過進一步實驗評估己醛和丁香醛是否可以作為評價金銀花風味和質量的指標性成分。與傳統的人工鼻聞和口嘗的評價方式相比，電子鼻和電子舌具有重復性好、數據電子化、便于描述等優點，可以對氣味和味道進行科學定量的評價[10-11]，近年來已被應用于多種中藥的研究。研究結果顯示電子鼻和電子舌均能對不同產地的金銀花進行良好的區分，說明產地的不同會使金銀花樣品風味產生較大差異。在未來，智能感官技術在中藥研究方面的應用將會更加廣泛和全面。

本研究采用HS-GC-MS、電子鼻和電子舌技術結合PCA 及OPLS-DA 對不同產地金銀花的揮發性成分、氣味和味道差異進行研究，為金銀花產地鑒別及質量評價提供了參考，對規范金銀花市場具有一定指導意義。但對以上差異形成的具體原因，本文未深入探究，后期可對不同產地金銀花間的差異與產地環境的相關性展開深入研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突