白藜蘆醇通過MCU抑制mPTP開放減輕H9c2細胞氧化應激損傷

劉天宇 張欣宇 郭佳寶 王培 賀永貴 習瑾昆, 鄭桓

(華北理工大學 1基礎醫學院 河北省慢性疾病基礎醫學重點實驗室,河北 唐山 063210;2公共衛生學院;3臨床醫學院)

氧化應激是導致心肌細胞死亡的重要原因,是缺血性心臟病發生的重要環節,可以引發動脈粥樣硬化、心肌缺血/再灌注損傷等。因此,減輕心肌細胞氧化應激損傷是心肌保護的重要策略之一〔1〕。 白藜蘆醇(resveratrol)屬于非黃酮多酚類化合物,從最初“法國悖論”開始,白藜蘆醇的生物學效應得到廣泛關注,其中最重要的就是心腦血管保護作用〔2〕。白藜蘆醇通過誘導藥物性預處理和后處理機制保護缺血/再灌注心臟,氧化應激、內質網應激、凋亡、自噬、一氧化氮等參與其心肌保護作用〔3,4〕。本實驗室早期研究也證實,白藜蘆醇通過環磷酸鳥苷(cGMP)/環尿苷酸依賴性蛋白激酶(PKG)信號使糖原合成酶激酶(GSK)-3β失活,通過與線粒體靶向素環蛋白(Cyp)D結合阻止線粒體通透性轉移孔(mPTP)的開放,從而保護再灌注心臟〔5〕。

線粒體膜上存在的mPTP在心肌缺血/再灌注損傷中起關鍵作用。mPTP在再灌注早期開放并導致心肌細胞損傷,阻止再灌注時mPTP開放,可以減輕缺血/再灌注損傷,因此也被稱為最終效應器〔6〕。研究顯示,心肌梗死與重塑的病理基礎是心肌細胞死亡,包括自噬、線粒體死亡途徑、凋亡、壞死、焦亡和鐵死亡,其中mPTP開放引起線粒體死亡途徑與心肌損傷關系密切〔7〕。因此,阻止mPTP開放是有效保護心肌細胞的關鍵。白藜蘆醇預處理可以減輕Ca2+超載,進而阻止mPTP開放。本實驗室研究顯示,Res通過增加細胞內鋅離子(Zn2+)阻止mPTP開放,減輕缺氧/復氧損傷,保護內質網應激(ERS)的心肌細胞〔3,5〕。內質網是細胞內Zn2+的貯藏所,外界因素刺激能夠促進Zn2+從內質網中釋放,與此同時,Zn2+同樣能夠維持內質網正常功能〔7〕。

本實驗室最新研究證實,Zn2+通過線粒體鈣離子單向轉運蛋白(MCU)影響細胞內鈣離子(Ca2+)和活性氧(ROS)進而阻止mPTP的開放,保護H9c2心肌細胞〔8～10〕。然而,白藜蘆醇是否通過MCU抑制mPTP開放及其機制尚不得而知。本研究利用大鼠H9c2心肌細胞,用過氧化氫(H2O2)建立氧化應激模型,探究Res是否通過MCU阻止mPTP開放從而發揮心肌細胞保護作用,并探討可能的信號轉導機制。

1 資料與方法

1.1主要儀器與試劑 白藜蘆醇(美國Sigma公司,批號:038K5202);四甲基羅丹明乙酯(TMRE)紅色熒光染料(美國Molecular Probes公司,批號:T669);Fluo-4AM 熒光染料(Thermo Fisher Scientific公司,批號:F14201);葡萄糖調節蛋白(GRP)78、GRP94、MCU mAb,β-tubulin mAb,Anti-rabbit IgG辣根過氧化物酶(HRP)-linked Antibody等抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司;Opti-MEM培養基(美國Gibco公司),MCU siRNA(中實基因科技有限公司),LipofectamineTM3000(美國Invitrogen公司),二喹啉甲酸(BCA)蛋白試劑盒、電化學發光(ECL)試劑盒、ROS試劑盒〔2,7-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)熒光染料〕、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)快速配制試劑盒均購自碧云天生物技術研究所;釕紅(Sigma-Aldrich公司,批號:00541-1G)。CO2孵育箱(Forma公司產品);CKX31倒置相差顯微鏡;FV 1000激光掃描共聚焦顯微鏡(日本OLYMPUS公司);高速冷凍離心機(德國IKA公司)。

1.2細胞培養 大鼠胚胎心臟組織來源H9c2細胞株(美國標準菌種收藏中心,ATCC),用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的DMEM培養基,置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。2～3 d換液,細胞融合達85%時,以0.25%胰蛋白酶乙二胺四乙酸(EDTA)消化傳代。

1.3實驗分組 實驗隨機分為4組:①對照組:心肌細胞常規培養。②H2O2組:200 μmol/L H2O2孵育20 min。③白藜蘆醇+H2O2組:100 μmol/L白藜蘆醇、200 μmol/L H2O2各孵育20 min。④釕紅+白藜蘆醇+H2O2組:20 μmol/L釕紅孵育30 min、100 μmol/L白藜蘆醇、200 μmol/L H2O2各孵育20 min。

1.4乳酸脫氫酶(LDH)法檢測細胞損傷程度 細胞根據實驗分組進行給藥預處理,吸取上清液,1 000 r/min離心5 min。根據LDH試劑盒說明書向空白孔、標準孔、對照孔、測定孔中加入各類試劑及離心后的上清液?；靹?37 ℃孵育15 min,將每孔加入2,4-二硝基苯肼0.025 ml,混勻,37 ℃孵育15 min,各孔加入0.4 mol/L氫氧化鈉溶液0.25 ml,混勻,室溫放置5 min。在酶標儀450 nm處測定各孔的吸光度值,繪制標準曲線,根據公式進行計算。

1.5Western印跡檢測GRP78、GRP94、MCU蛋白的表達 細胞生長至90%融合狀態,根據實驗分組處理細胞。生理鹽水沖洗3次后每組加入50 μl新鮮配制的細胞裂解液,冰上裂解30 min。收集裂解液,超聲波處理器進一步破碎,于12 000 r/min(-4 ℃),離心15 min。取上清,BCA測定蛋白濃度,按照酶標儀測定結果進行蛋白分裝,將蛋白煮沸后上樣、電泳、轉膜。10%脫脂牛奶室溫封閉60 min,GRP78、GRP94、MCU、β-tubulin等抗體(1∶1 000稀釋),4 ℃孵育過夜。二抗(1∶2 000稀釋)室溫孵育2 h,ECL熒光顯色。ImageJ軟件對圖像進行灰度分析并統計。

1.6MCU siRNA轉染 首先進行MCU沉默RNA的篩選。3種MCU siRNA序列號分別為374、761、984。按序列號分組,將陰性siRNA(NC組)作為參考,Western印跡檢測3種MCU siRNA(分別為MCU374、MCU761及MCU984組)沉默效率。細胞接種于6孔板中(8×104個/孔),密度約50%時進行轉染,將6孔板中的培養基棄去,加入1 800 μl Opti-MEM培養基。分別用92.5 μl Opti-MEM培養基稀釋7.5 μl NC siRNA、7.5 μl MCU siRNA、7.5 μl LipofectamineTM3000并混勻,將上述稀釋的 LipofectamineTM3000分別加入稀釋的NC siRNA和MCU siRNA混合輕輕振蕩并室溫孵育20 min,于6孔板中置于37 ℃、5% CO2條件下培養48～72 h進行后續實驗。采用Western印跡檢測白藜蘆醇對MCU蛋白表達的影響,分組為陰性siRNA為NC siRNA Con組、加H2O2陰性為NC siRNA H2O2組、加白藜蘆醇和H2O2陰性為NC siRNA Res+H2O2組、加MCU siRNA的白藜蘆醇和H2O2為MCU siRNA Res+H2O2組。

1.7激光掃描共聚焦顯微鏡檢測細胞內Ca2+、ROS、mPTP 細胞培養于共聚焦專用小皿內,密度適合生長狀態良好時,將皿中培養基棄去,生理鹽水洗滌3次,將稀釋好的染料均勻加入共聚焦小皿,于37 ℃下培養20～30 min,生理鹽水洗滌3次,加入2 ml空白培養基,選取合適的視野,通過激光掃描共聚焦顯微鏡檢測熒光強度。細胞內Ca2+用Fluo-4 AM熒光探針測定;細胞內ROS用DCFH-DA熒光探針測定;線粒體膜電位用TMRE熒光探針測定進而了解mPTP的開放程度。

1.8統計學分析 采用SPSS26.0及GraphPad Prism8軟件分析,完全隨機設計的單因素方差分析(one-way ANOVA)進行多組均值的組間差異比較。

2 結 果

2.1白藜蘆醇抑制氧化應激引起的ERS 與對照組相比,H2O2使GRP78和GRP94蛋白表達明顯增加,白藜蘆醇明顯抑制此作用,釕紅明顯加強了白藜蘆醇的作用(P<0.05),說明白藜蘆醇可能通過MCU抑制氧化應激引起ERS。見圖1、表1。

1～4:對照組、H2O2組、白藜蘆醇+H2O2組、釕紅+白藜蘆醇+過氧化氫組

2.2白藜蘆醇通過MCU抑制氧化應激 與對照組相比,H2O2處理后的心肌細胞LDH漏出明顯增加,白藜蘆醇明顯減少H2O2誘導的LDH增多,而釕紅明顯加強了白藜蘆醇的作用(P<0.05),說明氧化應激誘導心肌細胞損傷,白藜蘆醇可能通過MCU抑制氧化應激誘導的心肌細胞損傷。見表1。

2.3白藜蘆醇對MCU蛋白表達的影響 與NC組(1.00±0.06)比較,MCU374、MCU761及MCU984組MCU siRNA活性(0.81±0.05、0.48±0.08、0.61±0.04)顯著降低(F=42.39,P<0.05),說明3種MCU siRNA均可沉默MCU,其中MCU761沉默效率>50%,故后續實驗采用MCU siRNA 761。與對照組相比,H2O2使MCU蛋白表達明顯增加,白藜蘆醇明顯抑制了H2O2的作用,而釕紅明顯加強了白藜蘆醇的作用(P<0.05)。說明白藜蘆醇通過MCU抑制H2O2誘導的氧化應激。與NC siRNA Con組(1.00±0.02)比較,NC siRNA H2O2組MCU 蛋白表達(2.05±0.17)顯著增高(P<0.05)。與NC siRNA H2O2組比較,NC siRNA Res+H2O2組MCU 蛋白表達(1.44±0.21)顯著降低(P<0.05)。與NC siRNA Res+H2O2組比較,MCU siRNA Res+H2O2組MCU 蛋白表達(0.80±0.11)顯著降低(P<0.05)。以上結果證實白藜蘆醇通過MCU抑制H2O2誘導的氧化應激。見圖1、表1、圖2、圖3。

2.4白藜蘆醇對細胞內Ca2+的影響 與對照組相比,過氧化氫使Fluo-4AM綠色熒光強度顯著增強(P<0.05),說明氧化應激使細胞內Ca2+增多,白藜蘆醇明顯抑制了過氧化氫引起的熒光強度增強,而釕紅明顯加強了白藜蘆醇的作用(P<0.05),說明白藜蘆醇通過MCU抑制過氧化氫誘導的細胞內Ca2+超載。見表1、圖4。

2.5白藜蘆醇對細胞內ROS的影響 與對照組相比,H2O2使H9c2心肌細胞中DCFH-DA綠色熒光強度顯著增強,白藜蘆醇明顯抑制H2O2引起的熒光強度增強,而釕紅則明顯增強了白藜蘆醇的作用(P<0.05),說明白藜蘆醇通過MCU抑制H2O2誘導的細胞內ROS增多。見表1、圖4。

2.6白藜蘆醇對線粒體膜電位(mPTP開放)的影響 與對照組相比,H2O2使線粒體TMRE紅色熒光強度顯著降低,白藜蘆醇明顯抑制了TMRE熒光強度的降低,而釕紅明顯增強了白藜蘆醇的作用(P<0.05),說明白藜蘆醇通過MCU抑制H2O2誘導的mPTP開放。見表1、圖5。

表1 各組GRP78、GRP94、LDH、MCU蛋白表達及Fluo4-AM、DCF、線粒體膜電位(mPTP開放)的影響

圖2 Western印跡檢測MCU siRNA表達

1～4:NC siRNA Con組、NC siRNA H2O2組、NC siRNA Res+H2O2組、MCU siRNA Res+H2O2組

圖4 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測白藜蘆醇對細胞內Ca2+及ROS的影響(×500)

圖5 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測白藜蘆醇對線粒體膜電位(mPTP開放)的影響(×500)

3 討 論

心血管病是國內致死或致殘的主要原因之一,且近年來,隨著社會生活水平的不斷發展,冠心病的發病率也隨之升高,防治心血管疾病刻不容緩〔11〕。心血管病的發病機制包括氧化應激、線粒體損傷、凋亡、自噬、Ca2+超載等,其中氧化應激損傷是致病的主要因素。

白藜蘆醇是從植物中提取的多酚類化合物,也是植物體在惡劣環境或遇到病毒侵害時分泌的一種抗毒素,可從不同植物品種中獲得,其中葡萄、虎杖、花生等藥用植物中的含量較高。研究表明,白藜蘆醇可以保護H9c2心肌細胞免受缺氧/復氧損傷,可能與激活PTEN誘導激酶(PINK)1/Parkin信號通路促進線粒體自噬有關〔12〕。也有研究證明,白藜蘆醇通過血紅素加氧酶1的上調作用降低MiR-136-5p的表達,并對百草枯誘導的PC12細胞發揮神經保護作用〔13〕。課題組前期研究證實,白藜蘆醇通過增加細胞內的鋅離子進而抑制mPTP開放保護心肌細胞,進一步研究證實,鋅離子通過線粒體MCU阻止mPTP開放,發揮H9c2心肌細胞保護作用。氧化應激是心肌細胞死亡的重要原因,白藜蘆醇是否通過mPTP和MCU減輕心肌細胞氧化應激損傷尚不得而知。

內質網是心肌細胞重要細胞器,主要參與細胞內蛋白質合成、鈣穩態和凋亡的調節。當內質網出現功能紊亂和應激的時候,會誘發蛋白錯誤折疊,缺血缺氧、氧化應激等內在應激刺激,可誘發內質網折疊蛋白質過程紊亂,即ERS。MCU位于線粒體內膜并負責線粒體內Ca2+的轉運,通過MCU攝取的Ca2+失調會導致細胞功能紊亂,最終細胞凋亡。線粒體Ca2+的攝取需要MCU復合物共同完成,MCU復合物包括MCU及調節亞基(MICU、MCUb、EMRE)〔14〕。線粒體是細胞產生三磷酸腺苷(ATP)的場所,其參與體內多種代謝和信號調節,線粒體受損可引發細胞或器官損傷,線粒體完整性在減輕心肌細胞損傷中起著關鍵作用,是心肌細胞正常存活的關鍵調節點。有文獻表明,中等濃度的H2O2后處理顯著激活線粒體信號轉導及轉錄激活蛋白(STAT)3,并抑制MCU減輕缺血再灌注誘導的心室肌細胞鈣超載和收縮抑制〔15〕。此外,MCU在缺血再灌注期間過度開放,并通過MCU-Ca2+超載-mPTP開放的機制參與心肌再灌注損傷〔16〕。由此,本文推測,白藜蘆醇可能通過MCU抑制mPTP開放,發揮心肌細胞保護作用。LDH是臨床診療中常見的心肌損傷評估指標之一,也是診斷心肌梗死的常用指標。LDH有5個同工酶,其中心臟或心肌細胞中的含量較多,當細胞因外界因素受損時,心肌細胞中的LDH由于膜通透性改變釋放到細胞外液中,LDH含量與心肌細胞受損程度呈正相關。本文提示,白藜蘆醇可能通過MCU抑制H2O2誘導的心肌細胞損傷,發揮心肌細胞保護作用。

Ca2+是細胞內重要的第二信使,在細胞正常代謝中發揮重要作用。Ca2+超載導致ROS類物質過度生成,mPTP開放,線粒體裂變過度,最終導致細胞凋亡〔17〕。MCU是線粒體膜上的Ca2+通道蛋白,白藜蘆醇抑制過氧化氫引起的MCU增加,白藜蘆醇可能影響細胞Ca2+代謝。本研究說明,氧化應激使細胞內Ca2+超載,白藜蘆醇通過MCU抑制氧化應激誘導的細胞內Ca2+超載。細胞中ROS的增多破壞抗氧化防御的相對平衡狀態,從而引發細胞氧化應激反應,最終加速心肌細胞凋亡。同時,ROS導致Ca2+穩態破壞,線粒體內Ca2+超載,并介導mPTP開放〔18〕。由此可見,ROS大量生成和細胞內Ca2+濃度相關。本研究結果說明,氧化應激使細胞內ROS增多,白藜蘆醇通過MCU抑制H2O2誘導的細胞內ROS增多。

線粒體通過氧化磷酸化產生ATP,是能量代謝、信號轉導的重要細胞器,在心臟疾病的發病機制中發揮重要作用,是心肌損傷后心肌細胞命運的決定因素。ROS的過度產生、細胞Ca2+超載等引發mPTP開放,使線粒體膜電位下降,線粒體ATP產生障礙并啟動細胞死亡途徑,因此,mPTP是心肌保護重要靶點。本課題組先前研究證明,白藜蘆醇通過細胞外調節蛋白激酶(ERK)/糖原合成酶激酶(GSK)-3β通路增加細胞內Zn2+阻止mPTP開放,保護H9c2心肌細胞,進一步研究顯示,Zn2+通過MCU阻止mPTP的開放。本文結果提示,白藜蘆醇通過MCU抑制H2O2誘導的mPTP開放,保護H9c2心肌細胞。