地塞米松注射液聯合美能片治療大鼠皮膚壓迫性注射膠原蛋白導致過敏的研究

黃家鑫，黃 冉，李宏強

（1.杭州碧妍哲理健康管理有限公司金沙天街醫療美容診所，浙江 杭州，311500；2、斐縵（長春）醫藥生物科技有限責任公司,吉林 長春，130012）

膠原蛋白（Collagen）是人體內最重要且分布最廣泛的蛋白質之一，是細胞外基質中的一種由三條左旋多肽α-鏈纏繞而成的生物大分子[1]，約占體內總蛋白質含量的30%，其中50%以上的膠原蛋白位于人體皮膚組織中。膠原蛋白有很多重要的生物學特性，如低免疫原性、強親水性、生物可降解性、生物相容性、促凝血功能等[2-4]。膠原蛋白是構成皮膚組織基本結構的重要組成部分，會隨年齡增長逐漸流失，出現皮膚松弛、皮膚彈性降低、皺紋等衰老表現。所以近年來，膠原蛋白作為生物醫用材料，在整形美容領域的應用越來越廣，如消除皺紋、凹陷填充、面部塑形、提亮膚色等[5-9]。

目前膠原蛋白按功能可分為兩類：（1）成纖維膠原，有I、II、III、XI、XXIV、XXVII 型等，占膠原總量的90%；（2）成纖維膠原，目前已知獲國家級相關部門批準的可注射的膠原有十種以上[8]。隨著技術發展，膠原蛋白已不單純是填充劑，同時也是植入劑、再生劑或修復劑[8]。膠原蛋白以最符合人體中I型膠原與III型膠原配比的復合膠原，通過補充、誘導、刺激，重建膠原纖維，重塑皮膚纖維結構，合成新膠原，促進組織再生。

盡管如此，在臨床運用中仍然發現不少患者在注射后會出現過敏反應，通過臨床實踐發現，可能原因是操作醫生錯誤的注射方法（注射時壓迫血管）所致。針對這一情況，臨床上目前尚未明確統一的治療方案，因此，本次研究將通過動物實驗來探索和驗證這一可能原因，并進一步探索應對該問題的有效治療措施。

1 材料與方法

1.1 材料與分組

選取SD 大鼠，25 只，7-8 周，雌性（北京斯貝福實驗動物有限公司，合格證號NO：1102141911032015，飼養于 SPF 環境內，溫度22±2℃，濕度 68%，明暗 12 陰性對照生理鹽水）。共有6組，每組5只，分為對照組：采用生理鹽水進行淺表皮內注射；皮內注射組：采用醫用膠原蛋白進行淺表皮內注射；壓迫性皮內注射組：采用壓迫血管的方式進行醫用膠原蛋白皮內注射；陽性藥物組：采用C48/80，15 μg/mL進行皮內注射。藥物研究時，壓迫性注射造模后分為地塞米松注射液聯合美能片給藥組（聯合用藥組）、地塞米松給藥組（地塞米松組）、美能片給藥組（美能組）和生理鹽水對照組（對照組）。藥品試劑：醫用膠原蛋白[斐縵(長春)醫藥生物科技有限責任有限公司，國械注準：20163131609]，陽性藥物（中化藥品工業有限公司），地塞米松注射液（天津全耀藥業有限公司），美能片（復方甘草酸苷片，衛材藥業有限公司）。實驗試劑：伊文思藍（國藥集團化學試劑有限公司），4%多聚甲醛（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.2 造模與給藥

1.2.1 皮內注射與壓迫血管注射方法

以 75%酒精消毒皮膚，待干，取出藥物驅盡注射器內空氣。左手繃緊注射部位皮膚，右手持注射器，針頭斜面向上與皮膚成 5-15 度角刺入皮內。待針尖斜面全部進入皮內后以左手拇指固定針栓，右手推注藥液 0.1mL 可見圓形隆起的皮丘，并顯露毛孔。注射完畢拔出針頭，切勿按壓勿用碘酊消毒皮膚。勿揉擦、蓋住注射部位。壓迫血管注射操作步驟同皮內注射，但不同的是需尋找血管豐富處皮膚進行。注射時，右手未懸空，直接壓在皮膚上，且針頭直接壓在皮膚上進行注射。

1.2.2 給藥方法與取材

尾靜脈注射 0.1%的伊文思藍溶液，10 mL/kg，注射完成后動物背部備皮，行脊柱周圍4 個點注射，膠原內皮注射組動物皮內注射膠原 0.1 mL，壓迫組進行壓迫血管注射方法注射膠原蛋白，陽性藥物組注射 0.5 mg/100 ul，可造成快速過敏反應。藥物研究時，壓迫性皮下注射造模后，隨機分為四組，共給藥7 天。第1 天，聯合用藥組和地塞米松組分別腹腔注射藥物地塞米松，美能組和對照組分別腹腔注射等量生理鹽水，隨后每2 天，聯合用藥組進行地塞米松+美能片灌胃，地塞米松組進行地塞米松灌胃，美能組進行美能片灌胃，對照組進行等量生理鹽水灌胃。第7天給藥后2 小時各組動物尾靜脈注射0.1%伊文思藍10 mL/kg。隨后處死大鼠，剪開腹腔，用生理鹽水沖洗腹腔，收集洗滌液5 mL。然后取皮下注射位置皮膚進行病理實驗。

1.2.3 伊文思藍含量測定

將收集到的洗滌液，在723 型分光光度計于61 0nm 波長處測定吸收值，計算伊文思藍滲出量。

1.2.4 HE 染色

大鼠皮膚組織在4% 中性緩沖福爾馬林中固定24 h后，將組織包埋在石蠟中，切片后，進行蘇木堿伊紅染色。使用 LEICA DM 2500 顯微鏡獲取圖像。

1.3 統計學分析

應用SPSS 23.0軟件進行分析，各組間比較采用ANOVA方法進行方差分析，兩組間比較采用配對t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組皮內注射后大鼠背部皮膚變化比較

可見陽性對照組動物背部快速過敏反應，皮膚包塊比前兩組大，注射點位明顯水腫，壓迫性皮內注射組，可見注射點位水腫，但不如陽性藥物組明顯，見圖1。

圖1 各組皮內注射后大鼠背部皮膚變化比較

2.2 各組間皮內注射后大鼠背部皮膚藍斑變化比較

陽性藥物組注射后，注射點有明顯水腫，且藍斑逐漸明顯（見圖2 A紅色箭頭所指）。而皮內注射組和壓迫性注射組未見明顯藍斑（見圖2 B）。

圖2 各組間皮內注射后大鼠背部皮膚藍斑變化比較

2.3 伊文思藍結果分析

與對照組相比，陽性藥物組和壓迫性皮內注射組伊文思藍滲出量顯著升高（P＜0.01）。而皮內注射組伊文思藍滲出量雖有升高趨勢，但與對照組相比無統計學差異，見圖3。

圖3 各組間伊文思藍含量比較

圖4 各組組織HE 染色后的病理變化（×100）

圖5 藥物治療后四組間伊文思藍含量比較

2.4 各組病理結果

病理結果顯示皮內注射組組織整體結構基本正常，表皮角質層結構清晰，未見明顯角化過度角化不全，表皮細胞未見明顯疏松水腫，真皮層膠原纖維豐富組織未見明顯炎癥細胞就浸潤（見圖3 A）。壓迫性皮內注射組組織整體結構輕度異常，表皮角質層結構清晰，未見明顯角化過度角化不全，真皮層可見明顯疏松水腫（見圖3 B紅色箭頭所示），且組織可見炎癥細胞浸潤（見圖3 B黑色箭頭所示）。陽性藥物組組織整體結輕度異常，表皮角質層結構清晰，未見明顯角化過度角化不全，真皮層可見膠原纖維斷裂明顯疏松水腫（見圖3 C黑色箭頭所示），真皮層毛囊數量明顯增多（見圖3 C紅色箭頭所示），組織未見明顯炎癥細胞浸潤。

2.5 藥物治療后伊文思藍結果分析

在壓迫性注射醫用膠原蛋白后，與生理鹽水對照組相比，單獨地塞米松治療和單獨美能片治療，均無明顯變化。但經過地塞米松注射液聯合美能片治療后，伊文思藍滲出量雖無統計學意義（P＞0.05），但呈降低趨勢。表明藥物治療后血管通透性有所降低。

2.6 藥物治療后病理結果

病理結果顯示對照組組織存在大量炎性細胞浸潤，以分葉核白細胞為主，纖維母細胞增生。而經過藥物治療后，地塞米松組和美能組組織均出現較少炎性細胞浸潤，聯合用藥組出現少量炎性細胞浸潤、纖維母細胞增生。見圖6。

圖6 藥物治療后兩組組織HE 染色后的病理變化（×200）

3 討論

目前動物源性膠原蛋白生物材料主要是從牛、豬等中提取。近年來隨著膠原蛋白酶解去端肽技術成熟，動物源性膠原蛋白發生過敏反應的概率逐漸降低。臨床上發生過敏的常見原因多為個人體質原因或膠原蛋白變性[7，11-12]。但在嚴格篩選注射人群，嚴格把控膠原蛋白儲存條件的情況下，不正確的注射方式成為導致患者出現過敏反應又一要因。因此本次研究我們應用大鼠模擬可能出現的錯誤操作來驗證其與過敏反應的相關性。

臨床結果以及病理結果表明，在大鼠表皮進行壓迫性注射（即壓迫血管注射）后，會出現與陽性藥物所致過敏相似的反應，只是過敏反應相對較輕。伊文思藍在正常情況下是不會滲出的，而壓迫性注射組的明顯升高，這表明表皮血管通透性增高，此時發生了過敏反應[11,13]。因此，可以認為錯誤的注射方式可能造成患者出現相應過敏癥狀。

目前臨床研究中，醫生對于壓迫性注射膠原蛋白導致過敏的治療措施知之甚少，因此我們基于前期壓迫性注射大鼠模型，對此進行進一步的研究。

地塞米松因其具有抗炎、抗風濕、抗過敏以及免疫抑制作用而被應用于治療炎癥、過敏、自身免疫性疾病等治療中[13]。其原理可能是地塞米松注射液可降低毛細血管通透性，減少局部滲出，從而有利于過敏癥狀好轉。而在腫瘤化療患者經外周靜脈穿刺中心靜脈置管(peripherally inserted central venous catheters,PICC) 相關皮膚過敏研究中發現地塞米松注射液可有效地改善PICC引起的皮膚過敏[14,15]。

美能片即復方甘草酸苷片，目前藥理學研究表明其主要成分甘草酸二銨可抑制肥大細胞顆粒、組胺和緩激肽等介質的釋放[16]，此外其還具有抑制局部過敏壞死反應和施瓦茨曼現象(Shwartzman Phenomenon)等抗過敏作用，對皮質激素有著增強抑制應激反應的作用，但對激素的滲出作用無影響[17,18]。因此，基于這兩種藥物的特性，本次實驗利用地塞米松注射液聯合美能片來研究其對壓迫性注射所致過敏的療效。研究發現，給藥組大鼠在分別服用地塞米松注射液和美能片，以及聯合用藥后，其病理結果顯示炎癥相比于對照組有著明顯改善，并且聯合用藥效果更佳。同時，伊文思藍結果也表明血管通透性有所降低。兩項結果皆證明地塞米松注射液聯合美能片對治療壓迫性注射膠原蛋白所引起的過敏反應有一定的療效。

綜上所述，壓迫性注射是造成注射膠原蛋白時出現過敏反應的可能原因，聯合應用地塞米松注射液和美能片可以有效地改善壓迫性注射所致的過敏反應。

然而壓迫性注射所致過敏以及地塞米松注射液和美能片如何改善過敏反應的機制均尚不清楚，因此我們將就此開展更深層次的研究，探索相關病理生理機制、提供更多的理論依據，為臨床用藥提供更多思路。