基于網絡藥理學與分子對接探討運脾化濕清肺湯治療特應性皮炎的作用機制*

常秋伊,倪驥杰,宋瑜

1.上海浦東新區光明中醫醫院,上海 201399; 2.上海市閔行區浦江社區衛生服務中心,上海 201112;3.上海中醫藥大學附屬龍華醫院,上海 200032

特應性皮炎(atopic dermatitis,AD)屬于臨床常見的皮膚病之一,是一種反復發作的慢性、炎癥性、非傳染性疾病,以劇烈瘙癢、皮膚干燥和反復發作的濕疹樣皮炎等為主要表現。全球范圍內,超過20%的兒童和3%的成人罹患AD[1]。近20年來,我國AD的發病率呈現逐年上升的趨勢[2-3]。

AD病因復雜,僅以抗過敏藥物聯合外用激素藥膏治療往往療效不佳。運脾化濕清肺湯是根據上海市名中醫馬紹堯多年臨床經驗總結而成。臨床研究表明,運脾化濕清肺湯治療60例AD患者的臨床有效率達100%,并可降低血清白細胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、可溶性IL-2 受體(soluble IL-2 receptor,sIL-2R)水平[4-5],但具體機制及作用靶點尚不明確。因此,本研究基于網絡藥理學與分子對接方法,篩選運脾化濕清肺湯的活性成分,分析其治療AD的信號通路及核心靶點,為后續基礎和臨床研究提供思路和方向。

1 資料與方法

1.1 運脾化濕清肺湯活性成分及作用靶點篩選通過中藥網絡藥理學分析系統(TCM network pharmacology analysis system,TCMNPAS)v1.0[6](http：//54.223.75.62：3838/)檢索運脾化濕清肺湯(陳皮、枳殼、桑葉、菊花、金銀花、黃芩、土茯苓、白鮮皮、白術、甘草)的活性成分和作用靶點,以定量評估類藥性(quantitative estimate of drug-likeness,QED)閾值為0.2進行篩選[7],數據庫來源為中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)、中藥綜合數據庫(traditional Chinese medicines integrated database,TCMID)、草藥成分和靶標數據庫(herbal ingredients′ targets platform,HIT);查閱已發表文獻中運脾化濕清肺湯所含藥物的活性成分和作用靶點[8]。運用Cytoscape 3.8.0軟件構建“藥物-活性成分-作用靶點”網絡。

1.2 AD疾病靶點篩選以“atopic dermatitis”(疾病編號：C0011615)為關鍵詞,通過GeneCards(https：//www.genecards.org/)數據庫、DrugBank(https：//www.drugbank.ca/)數據庫獲取AD疾病靶點,GeneCards數據庫的檢索結果中去除Score中位數以下的靶點;查閱已發表文獻中AD的疾病靶點,從而篩選運脾化濕清肺湯治療AD的靶點。

1.3 蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡構建及核心靶點篩選利用jvenn平臺(http：//jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html)[9]獲取運脾化濕清肺湯與AD的交集靶點并繪制韋恩圖。將交集靶點上傳至STRING數據庫(https：//string-db.org/),物種設置為“Homo sapiens”,最低相互作用閾值設為0.4,不隱藏游離節點,得到PPI網絡。將PPI網絡導入Cytoscape 3.8.0軟件,使用Analyze Network插件進行拓撲分析,選取同時滿足高于平均自由度、平均中介中心性、平均接近中心性且低于平均最短路徑長度的靶點,作為運脾化濕清肺湯治療AD的核心靶點。

1.4 基因本體(gene ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析基于運脾化濕清肺湯與AD的交集靶點,通過Metascape數據庫(http：//metascape.org)進行GO功能分析(P<0.01,富集因子>1.5)和KEGG通路分析(P<0.01,富集因子>1.5)。借助imageGP平臺(https：//www.bic.ac.cn/BIC/)繪制條形圖和氣泡圖。將10個中藥、15個交集靶點以及KEGG通路導入Cytoscape 3.8.0軟件,共同構建“藥物-靶點-通路”網絡。

1.5 分子對接將運脾化濕清肺湯分為運脾藥組(陳皮、枳殼、白術)、化濕藥組(土茯苓、白鮮皮)、清肺藥組(黃芩、金銀花、桑葉、菊花)三類,取每組藥物中QED值排名前3位的活性成分作為配體;將核心靶點作為受體,通過PDB數據庫(http：//www.rcsb.org/)獲取受體蛋白的PDB ID,物種設置為“Homo sapiens”。基于TCMNPAS v1.0數據庫,采用PSOVina算法[10]對活性成分和核心靶點進行分子對接驗證,并采用PyMOL軟件進行可視化展示。

2 結果

2.1 運脾化濕清肺湯活性成分及作用靶點通過TCMNPAS v1.0數據庫及文獻檢索得到運脾化濕清肺湯活性成分243個、作用靶點344個;檢索TCMID數據庫,暫未發現運脾化濕清肺湯經水煎煮后出現新的活性成分。采用Cytoscape 3.8.0軟件構建“藥物-活性成分-作用靶點”網絡,該網絡包含612個節點和4 458條邊,節點越大,表明度值越大,見圖1。

注：CP：陳皮;ZK：枳殼;SY：桑葉;JH：菊花;JYH：金銀花;HQ：黃芩;TFL：土茯苓;BXP：白鮮皮;BZ：白術;GC：甘草;六邊形節點為活性成分,紫色菱形節點為作用靶點。

2.2 運脾化濕清肺湯治療AD的潛在靶點通過GeneCards數據庫、DrugBank數據庫篩選出AD疾病靶點145個。利用jvenn平臺繪制藥物作用靶點與AD疾病靶點的韋恩圖,得到15個交集靶點,可能是運脾化濕清肺湯治療AD的潛在靶點,見圖2、表1。

圖2 運脾化濕清肺湯作用靶點與AD疾病靶點的韋恩圖

2.3 PPI網絡及核心靶點通過STRING數據庫構建15個交集靶點的PPI網絡,該網絡包含15個節點和58條邊,見圖3;拓撲分析顯示,各節點的平均度值為7.733,平均最短路徑長度為1.467,平均中介中心性為0.036,平均接近中心性為0.707;根據這些指標進一步篩選得到4個核心靶點,節點越大,則表明度值越大,見表2。

表2 運脾化濕清肺湯治療AD的核心靶點信息

圖3 運脾化濕清肺湯治療AD的PPI網絡圖

2.4 GO和KEGG富集分析通過Metascape數據庫進行GO功能分析,篩選得到421個生物過程(biological process,BP),主要包括對細菌的應答、對脂多糖的應答、細胞對生物刺激的反應等;8個細胞組分(cellular component,CC),主要包括膜筏、初級內體、細胞質膜蛋白復合物等;7個分子功能(molecular function,MF),主要包括細胞因子受體結合、轉錄因子結合、肽結合等,見圖4。通過Metascape數據庫篩選得到55條KEGG通路,主要涉及炎癥信號通路(TNF信號通路等)、各類傳染性疾病(如克氏錐蟲、弓形蟲、瘧疾)、病毒感染(如單純皰疹病毒)等,排名前9位的KEGG通路見圖5。采用Cytoscape 3.8.0軟件構建“藥物-靶點-通路”網絡,節點越大,度值越大,見圖6。

圖4 GO富集分析條形圖

圖5 KEGG富集分析氣泡圖

注：CP：陳皮;ZK：枳殼;SY：桑葉;JH：菊花;JYH：金銀花;HQ：黃芩;TFL：土茯苓;BXP：白鮮皮;BZ：白術;GC：甘草;藍色節點為作用靶點,紫色節點為信號通路。

2.5 分子對接將運脾藥組、化濕藥組、清肺藥組中QED值排名前3位的活性成分作為配體,見表3;將核心靶點IL-6、TNF、CXCL8、MAPK1作為受體蛋白,利用TCMNPAS v1.0數據庫進行分子對接。研究顯示,配體與受體的最低結合能≤-5.0 kJ·mol-1說明兩者的親和性較好,最低結合能≤-7.0 kJ·mol-1說明兩者的結合構型極穩定[11]。結果顯示,活性成分與核心靶點的最低結合能基本≤-5.0 kJ·mol-1,其中最低結合能≤-7.0 kJ·mol-1的占53.13%,說明兩者具有較好的親和性和結合能力,見表4。使用PyMOL軟件對最低結合能排名前6位的結果進行可視化展示,見圖7。

表3 運脾藥組、化濕藥組、清肺藥組的主要活性成分

表4 三大藥組主要活性成分與核心靶點分子對接最低結合能kJ·mol-1

注：A：陳皮素與TNF;B：孕烷醇酮與TNF;C：黃芩黃酮I與TNF;D：陳皮素與MAPK1;E：孕烷醇酮與MAPK1;F：黃芩黃酮I與MAPK1。

3 討論

馬紹堯教授總結歷代醫家理論及自身臨床經驗,提出AD常見于兒童和青少年,其發病與小兒的生理和病理特點相關,尤與“肺常不足”“脾常不足”關系密切。馬紹堯教授提出“肺脾同調”的論治原則,并創制運脾化濕清肺湯。方中陳皮、枳殼為君藥,意在健運脾胃,使補而不滯;同時,兩藥味皆辛、苦,具有能散、能行的特點,藥后使脾氣升而胃氣降,脾氣運而濕氣去;金銀花、黃芩為臣藥,瀉上焦之火,散風熱、清肺化濕;桑葉、菊花皆疏風散熱、清肝明目,兩藥共用,以辛涼輕劑清除肺熱;土茯苓解毒除濕,白術健脾燥濕和中,兩者共奏培土健運燥濕之效;白鮮皮祛風燥濕、清熱解毒,為祛風止癢之要藥,上五味共為佐藥;甘草調和諸藥。全方標本同治、肺脾同調,共奏健脾祛濕、清肺解毒之功。

藥理學研究表明,運脾化濕清肺湯組成藥物所含的化學成分在減輕炎癥、調節免疫等方面具有顯著作用。例如,黃芩中的乙酸乙酯和黃芩素能有效改善AD小鼠的皮損癥狀,并抑制血清腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平升高[12];陳皮、枳殼所含的陳皮素可有效抑制變態反應過程中多種轉錄因子活化,降低白細胞介素-4(interleukin-4,IL-4)、TNF-α水平,抑制免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE)升高[13];桑葉、菊花水煎劑能降低血清白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、一氧化氮(nitric oxide,NO)及髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)含量從而抑制炎癥反應[14]。這與本研究得出的運脾化濕清肺湯活性成分、作用靶點結果相類似。

既往研究表明,AD的發生發展主要與皮膚屏障功能障礙、免疫應答異常、皮膚病原菌定植、遺傳基因突變及環境變化等因素密切相關。其中,免疫應答異常被認為是AD發病過程中的重要環節。富集分析結果顯示,運脾化濕清肺湯治療AD的作用途徑主要與抗炎、抗病毒、調節免疫、調節代謝等有關,以TNF信號通路、叉頭框蛋白O(forkhead box protein O,FoxO)信號通路、低氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)信號通路與AD的關系密切。TNF信號通路主要與Toll樣受體產生炎癥因子(如IFN-β、TNF)觸發細胞凋亡以及TNF受體相關因子(TNF receptor-associated factor,TRAF)介導的核轉錄因子-κB (nuclear transcription factor-κB,NF-κB)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)活化相關。TNF參與誘導炎癥反應,NF-κB也是與AD相關的炎癥通路之一[15]。FoxO與自身免疫性疾病關系密切,其活化受到磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3 kinase,PI3K)調節。FoxO活化后可同時調節B淋巴細胞和T淋巴細胞免疫等,包含由信號轉導因子和轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)介導的Janus激酶(Janus kinase,JAK)/STAT信號通路,產生IL-6、IL-10等炎癥因子[16-17]。HIF-1信號通路在機體缺氧情況下會持續表達HIF-1α,通過調控Bcl2/腺病毒E1B 19 kD相互作用蛋白3(Bcl2/adenovirus E1B 19 kDa interacting protein 3,BNIP3)等產生大量Bcline-1,進而影響自噬體形成[18]。研究表明,炎癥性疾病會產生大量HIF-1α,其在炎癥因子IL-1β和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的合成、表達中起著重要的調控作用[19]。

綜上所述,運脾化濕清肺湯可能通過多種活性成分、多個靶點及多條信號通路作用于AD。其中,化濕藥組(白鮮皮)和清肺藥組(黃芩)所含的化學成分呈現出較高的類藥性和活性,推測其可能是運脾化濕清肺湯治療AD的重要活性成分。本研究為運脾化濕清肺湯治療AD的單藥研究、拆方研究和機制研究提供了一定的理論依據和研究思路。