左歸丸調控PI3K/AKT信號通路的研究進展*

葉凡,張舒怡,劉佳樂,李馮銳

1.包頭醫學院,內蒙古 包頭 014000; 2.山東第二醫科大學附屬醫院,山東 濰坊 261000

左歸丸出自明代張景岳的《景岳全書·新方八陣》卷五十一,是滋陰補腎的代表方劑,此方由熟地黃、山藥、枸杞子、山茱萸、川牛膝、菟絲子、鹿角膠及龜板膠組成,八藥合用共奏滋陰補腎、填精益髓之功,主治真陰腎水不足,肝腎陰虧、精血不足、腦髓不充之證。左歸丸作為經典古方近年來在神經系統疾病、生殖系統疾病、內分泌系統疾病及骨科疾病等方面的基礎研究不斷深入,其藥理作用和對信號通路的調控及分子機制的研究亦取得一定進展。本文聚焦左歸丸調控PI3K/AKT信號通路對疾病發揮防治作用的實驗研究進行綜述,以期為左歸丸的基礎研究提供思路及參考,并挖掘其潛在臨床應用價值。

1 PI3K/AKT信號通路

PI3K/AKT信號通路存在于多種生物中,主要由磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(proteinkinase B,PKB)及其下游分子組成[1]。PI3K是一種胞內磷脂酰肌醇激酶,為p110催化亞基及p85調節亞基所組成的異源二聚體,具有SH2結構域,可因結合多種細胞因子磷酸化胞內段酪氨酸殘基從而被激活[2]。在膜脂代謝中,具有磷脂酰肌醇激酶活性的PI3K催化PI-4-P(PIP)生成PI-3,4-P2(PIP2),再催化后者生成PI-3,4,5-P3(PIP3)。這些產物都是細胞內重要的第二信使,作用于PI3K/AKT通路,在細胞的增殖、凋亡、代謝等過程中起重要的作用[3-4]。PKB 又稱AKT,是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,也是PI3K信號通路的主要下游靶點。目前發現,在哺乳動物中AKT有三種亞型AKTl(PKBα)、AKT2(PKBβ)和AKT3(PKBγ)。AKT1主要參與調節細胞生長和分裂,AKT2在細胞能量和代謝中發揮重要作用,AKT3被認為對大腦發育和惡性膠質瘤細胞的存活至關重要[5]。在靜息狀態下,AKT以非活性狀態存在于細胞質基質中。

當細胞受到內外源性刺激后,PI3K激活可導致幾乎所有細胞和組織中的AKT活化,完全活化的AKT從細胞膜上解離下來,進入細胞質基質和細胞核,通過磷酸化AKT不同位點精準調控其下游靶蛋白,發揮不同的生物效應,主要包括調節細胞周期,促進細胞代謝、生長及增殖,抑制細胞凋亡,調節氧化應激、炎癥反應及能量代謝等多種生物學過程[6-7]。

PI3K/AKT通路作為酶聯受體介導的重要信號轉導通路,主要依賴于下游B細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)[8]、B細胞淋巴瘤-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)[9]、半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Cysteinyl aspartate-specific proteinase-3,Caspase-3)[10]、糖原合成酶激酶3β (glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)[11]、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)[12]、叉頭轉錄蛋白O(forkhead box O,FOXO)[13]等靶蛋白發揮生物學功能。

Bcl-2蛋白家族是一種主要存在于線粒體外膜上的完整膜蛋白[14],通過調控線粒體凋亡影響細胞存活與凋亡,Caspase-3具有蛋白失活和切割作用,激活后可促進細胞凋亡[10]。激活PI3K/AKT信號通路可上調Bcl-2蛋白表達、下調Bax蛋白表達,磷酸化Caspase-3抑制其活性,發揮抗細胞凋亡作用[15];GSK3β是由軸蛋白(axis protein,Axin)、β-連環蛋白和腺瘤性結腸息肉病蛋白組成的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,可磷酸化多種內源性蛋白和轉錄因子,參與糖穩態調控、細胞生長發育、腫瘤發生等過程[16],激活PI3K/AKT信號通路可抑制GSK3β蛋白表達并提升細胞活性,同時激活的AKT可磷酸化GSK3使其失活,減弱其對糖原合成酶的抑制作用從而促進糖原合成、促進細胞對葡萄糖的利用,降低血糖水平[17];mTOR是屬于磷脂酰肌醇激酶相關激酶 (PIKK)家族[18],在細胞生存、生長、增殖及運動中扮演著重要角色,并參與轉錄與蛋白質合成,激活PI3K/AKT信號通路,上調mTOR磷酸化水平,促進細胞的生長、增殖,被激活的mTOR可升高血管內皮生長因子的表達,促進血管生成[19];FoxO家族成員可調控氧化應激、細胞增殖、凋亡及分化[20],FoxO1作為轉錄調控因子,與糖脂代謝密切相關,激活PI3K/AKT通路,活化的AKT可磷酸化FoxO1,調控磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和葡萄糖-6-磷酸酶基因的表達,抑制糖異生,促進糖酵解[17]。

2 左歸丸基于PI3K/AKT信號通路對疾病的防治作用

2.1 神經系統疾病中醫學理論提到腎為先天之本,《醫學正傳》曰：“腎元盛則壽延,腎元衰則壽夭。”腎藏精,而腎精化生髓通于腦,即腎之精氣充滿,則生髓足,腦髓得以滋養,腦的發育就會正常;反之,若腎精虧虛,則腦髓失養,會導致腦發育障礙[21]。腎對大腦功能的影響尤為重要,按照中醫學理論對神經系統疾病的防治可從補腎生精、填精益髓入手。

2.1.1 癡呆及認知功能障礙相關疾病左歸丸可抑制神經細胞凋亡并促進其生長發育,改善認知功能,提高學習記憶能力。張濤濤等[22]采用大鼠小腦顆粒神經元去極化建立細胞凋亡模型,觀察左歸丸水提液對細胞存活率、胞核形態學變化、DNA斷裂特性的影響并探討其改善癡呆癥的分子機理,發現左歸丸對低鉀所致的神經元凋亡具有保護作用,此種保護作用可被PI3K抑制劑LY294002阻斷,推斷左歸丸可通過調控PI3K/AKT信號通路而發揮抗神經元凋亡作用。在探究左歸丸保護睡眠剝奪所致認知障礙的研究中,張穎等[23]發現左歸丸治療組大鼠海馬組織中磷酸化PI3K(phosphorylated-PI3K,p-PI3K)、磷酸化AKT(phosphorylated-AKT,p-AKT)、Bcl-2表達均高于模型組,Bax、Caspase-3表達低于模型組,PI3K抑制劑可阻斷左歸丸上述作用,提示左歸丸可激活PI3K/AKT信號通路,上調Bcl-2/Bax并抑制Caspase-3蛋白表達,減少睡眠剝奪所致的神經細胞凋亡,對認知功能損傷發揮保護作用。

在腎虛所致神經元功能異常的研究中,有研究者發現左歸丸發揮抗凋亡、促進神經細胞活性的保護作用。Liu等[24]體外培養新生大鼠海馬神經干細胞,采用左旋單鈉谷氨酸模擬腎陰虛證模型,發現模型組神經干細胞增殖分化異常和細胞凋亡,進行左歸丸干預后,總AKT、p-AKT(Ser473)及p-AKT(Thr308)水平高于模型組,GSK3β(Ser9)表達降低,PI3K抑制劑可反轉上述改變,PI3K激動劑可增強上述變化,證實左歸丸通過激活PI3K/AKT通路,抑制下游靶蛋白GSK3β表達,促進細胞存活,發揮對海馬神經干細胞的抗凋亡作用。張小艷[25]以先天腎虛仔鼠模型為研究對象,在孕期行左歸丸填補母鼠腎精,發現左歸丸可間接升高仔鼠大腦皮質PI3K等相關因子表達,從而促進腦皮質發育并緩解仔鼠生長發育和學習記憶能力低下,左歸丸主要通過影響ADAMTS-4剪切調控Reelin蛋白,進而調控PI3K/AKT信號通路來實現。

2.1.2 腦缺血再灌注損傷腦缺血再灌注損傷是一種嚴重的腦血管疾病,常伴有缺血性腦卒中、腦梗死[26]。左歸丸通過抗細胞凋亡、緩解氧化應激和炎癥反應發揮對腦缺血再灌注損傷的保護作用。Liu等[27]分離大鼠神經干細胞并行氧糖剝奪及恢復誘導實驗,分析左歸丸對細胞活力和凋亡的影響,具體實驗方法為,采用大腦中動脈閉塞再灌注法建立大鼠腦缺血再灌注模型,評估左歸丸對神經功能、腦梗死面積和認知障礙的影響,發現左歸丸可減弱氧糖剝奪和恢復所致的細胞活力下降和細胞凋亡,可減少大鼠神經損傷和梗死面積并提升認知能力。劉家峰等[28]研究發現,左歸丸對腦缺血再灌注大鼠具有保護作用,并發現左歸丸可升高PI3K及AKT的磷酸化水平,上調下游蛋白Bcl-2的表達水平、下調Bax和Caspase-3的表達水平,而抑制劑可顯著削弱上述效應,證明左歸丸可調控PI3K/AKT信號通路及下游Bcl-2/Bax、Caspase-3蛋白表達,發揮抗神經細胞凋亡作用。相關細胞學實驗研究同樣揭示了左歸丸發揮神經細胞保護作用的機制。劉家峰等[29]對原代大鼠海馬神經元和膠質細胞的混合細胞給予氧糖剝奪并加左歸丸含藥血清,發現含藥血清組細胞存活率明顯上升,部分細胞氧化應激標志物和炎癥因子水平下降,p-PI3K、p-AKT、Bcl-2/Bax蛋白表達明顯上調,Caspase-3則明顯下調,抑制劑可顯著減弱上述改變,表明左歸丸可通過調控PI3K/AKT信號通路有效減弱氧糖剝奪引發的氧化應激和炎癥反應。

2.1.3 多發性硬化多發性硬化是一種中樞神經系統慢性炎性脫髓鞘自身免疫性疾病[30],樊永平等[31]通過實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型模擬多發性硬化動物模型及立體細胞模型,發現左歸丸可促進神經功能康復的多靶點信號分子網絡的調控模式,其中可通過上調PI3K/AKT等信號轉導,抑制Bax凋亡信號分子,激活mTOR,調節髓鞘蛋白的轉錄和翻譯,促進中樞神經系統中少突膠質細胞的生長存活[32],減輕多發性硬化動物模型的神經元損傷和炎性反應,促進機體恢復。

綜上所述,左歸丸對癡呆及認知功能障礙相關疾病、腦缺血再灌注損傷、多發性硬化的防治作用,主要通過直接或間接調控PI3K/AKT信號通路,增加PI3K、AKT的磷酸化水平,影響下游靶蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3、GSK3β、mTOR的表達,發揮抑制神經元凋亡、促進神經干細胞或原代細胞生長發育、調控膠質細胞生長、調節炎癥反應等保護作用,從而達到治療認知功能損傷、緩解學習記憶能力低下、增強神經細胞對缺血再灌注的適應能力及炎癥損傷的修復能力等,發揮神經保護作用。

2.2 生殖系統疾病“腎藏精,主生殖”,腎精可直接參與女性的生理活動,且對生殖器官及其功能起著重要的調節作用[33],提示左歸丸可以通過補腎生精來防治生殖系統疾病。

2.2.1 早發性卵巢功能不全早發性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency,POI)是指女性在40歲之前由于遺傳、免疫、環境等因素出現卵巢功能減退的臨床綜合征[34],左歸丸對POI有防治作用,并表現出多成分、多基因、多靶點的特點。曾麗華等[35]在基于網絡藥理學探討左歸丸治療早發性卵巢功能不全的機制研究中,發現了83個有效活性成分,通過功能富集分析及京都基因百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析發現,顯著性較高的信號通路包含PI3K/AKT、Cancer等,而Cancer通路中又包含PI3K/AKT等信號通路,提示左歸丸可能通過PI3K/AKT信號通路起到治療作用。王雨琦等[36]通過基因表達綜合(gene expression omnibus,GEO)數據庫進行早發性卵巢功能不全和健康人群的microRNAs差異分析、中藥系統藥理學數據庫及分析平臺(traditional Chinese medicines systems pharmacology platform,TCMSP)、KEGG富集分析,獲得左歸丸化裁方的65個交集靶點,其中包含了PI3K/AKT等多條信號通路,并涉及細胞自噬、細胞凋亡、炎癥反應等多個病理過程。該課題組采用動物模型對上述生物信息學分析結果進行驗證和深入研究,發現左歸丸化裁方組的卵巢組織中PI3K、AKT等表達升高,推測左歸丸化裁方可能通過上調PI3K并激活AKT,與一氧化氮合成酶結合生成一氧化氮,使血管舒張、重塑和生成,同時激活的PI3K/AKT信號通路可誘導血管內皮生長因子轉錄增加,形成正反饋調控,加速血管新生過程,發揮治療作用[36]。

左歸丸對藥物及輻射造成的卵巢功能早衰具有保護作用。劉小莉[37]、楊靜[38]均采用順鉑誘導卵巢早衰模型,并行左歸丸干預,發現左歸丸可改善卵巢組織內部結構,促進細胞增殖與卵泡發育,增多次級卵泡數量,減少閉鎖卵泡數量,發揮改善卵巢功能、延緩卵巢衰老的作用。左歸丸主要是通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路,降低顆粒細胞自噬水平,降低下游FoxO3a蛋白表達并促進Bcl-2蛋白表達,有效抑制顆粒細胞受損及凋亡。趙粉琴等[39]對γ射線輻射造成卵巢功能早衰的大鼠給予左歸丸干預一段時間后,同樣發現了卵母細胞和顆粒細胞增殖,顆粒細胞凋亡則被抑制,其藥理作用主要通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路、升高Bcl-2/Bax比值實現。有學者采用環磷酰胺建立卵巢早衰大鼠模型,探討左歸丸治療卵巢早衰的療效及機制,在治療前后測定性激素水平、血清炎癥因子水平、超聲參數及生長分化因子-9 (growth differentiation factor-9,GDF-9)/Smad2的表達水平,發現左歸丸可改善卵巢結構及功能,上調 GDF-9/Smad2表達,而Smad2則可根據PI3K激活的狀態調控細胞命運[40-41]。

2.2.2 多囊卵巢綜合征多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是以卵巢呈多囊樣改變、卵泡發育異常、胰島素抵抗和高雄激素血癥為主要臨床特征的一種內分泌疾病,是女性不孕的主要原因[42]。左歸丸治療PCOS的臨床效果良好,推測其藥物成分可調節子宮-卵巢-垂體性腺軸功能[43]。李臻[44]、莫陽等[45]對多囊卵巢綜合征大鼠行左歸丸干預后發現,AKT蛋白表達增加,磷酸化ERK1(phosphorylated-ERK1,p-ERK1)蛋白表達下降,鑒于有絲分裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調節激酶(mitogen-activated protein kinase/extracellular signalregulated kinase,MAPK/ERK)和PI3K/AKT兩條通路可相互作用,在生理狀態下各司其職,病理狀態下MAPK/ERK通路的異常激活可抑制PI3K/AKT通路,推測左歸丸治療多囊卵巢綜合征的機制可能是通過抑制MAPK/ERK通路的異常激活并上調PI3K/AKT通路中重要因子的表達,調節信號通路平衡,進而發揮治療作用。

2.2.3 子宮內膜損傷左歸丸可平衡激素水平,促進子宮內膜細胞增殖分化,增加子宮內膜厚度并對子宮內膜損傷有修復作用[46]。江春燕[47]研究發現,薄型子宮內膜增殖期PI3K及AKT mRNA表達較正常子宮內膜明顯下降,推測PI3K/AKT信號通路可能參與子宮內膜組織的增殖與分化,并對子宮內膜損傷大鼠模型給予左歸丸干預,發現受損子宮內膜有一定程度的修復,如受損子宮內膜增厚、腺體個數增加、子宮內膜纖維化程度減輕,同時發現PI3K、AKT蛋白表達升高,AKT磷酸化水平增強,提示上述改變可能與左歸丸激活PI3K/AKT信號通路有關,活化的AKT可激活血管內皮生長因子,促進子宮內膜血管形成,同時活化的AKT可促進Bcl-2蛋白表達并抑制Bax蛋白表達,抑制子宮內膜細胞凋亡、促進細胞增殖,從而發揮子宮內膜損傷的修復作用。

綜上所述,左歸丸對卵巢結構及功能的保護作用具有多成分、多基因、多靶點的特點。左歸丸及其化裁方可使卵巢組織中PI3K表達升高,AKT激活,增加一氧化氮合成酶活性,增加血管內皮生長因子轉錄,使血管舒張、重塑,加速血管新生。激活的PI3K/AKT信號通路調控其下游靶蛋白mTOR、Bcl-2、Bax、FoxO3a、Smad2的表達,促進卵母細胞和顆粒細胞生長增殖及發育,抑制細胞凋亡,調節炎癥反應,發揮對卵巢的保護作用;左歸丸可激活子宮內膜的PI3K/AKT信號通路,上調Bcl-2蛋白表達并抑制Bax蛋白表達,促進血管生成,抑制細胞凋亡,促進損傷子宮內膜的修復。

2.3 內分泌系統疾病中醫稱糖尿病為消渴,中醫認為精、氣、血虛衰不僅是萬病之源,也是導致胰腺分泌排放等功能失調的根本因素。消渴常見的證型有肝腎不足、肝腎虧虛等。腎藏精納氣、主津液代謝[48],故提示治療糖尿病可從補腎益精、溫壯腎陽入手。

左歸丸可調節糖酵解/糖異生、丙酮酸代謝、脂質代謝,起到預防糖尿病及相關代謝性疾病的作用。趙燦[49]基于網絡藥理學構建左歸丸干預2型糖尿病活性物質——潛在靶點網絡并通過KEGG通路富集分析篩選,發現左歸丸及其拆方后補陰、補陽藥物配伍均主要集中在PI3K/AKT等信號通路。該課題組采用MKR 2型糖尿病小鼠做進一步研究,行左歸丸及拆方后補陰、補陽藥物干預,發現實驗動物血糖下降,PI3K、AKT蛋白表達上升,且左歸丸效果優于拆方后補陰、補陽藥物,證實了左歸丸可通過上調PI3K、AKT蛋白表達并抑制下游FoxO1表達,降低糖異生并增加胰島素合成來干預2型糖尿病。郭亞菲等[50]采用血清化學實驗聯合網絡藥理學探究左歸丸治療糖尿病的機制,共篩選出左歸丸中的表馬錢苷酸、馬錢苷酸、莫諾苷等9種活性成分,提示其可調控PI3K/AKT信號通路促進葡萄糖攝取和糖原合成,發揮治療糖尿病的作用。許凱霞等[51]以ICR小鼠早期胚胎建立高葡萄糖模型并行左歸丸含藥血清體外培養,通過iTRAQ方法篩選差異蛋白并分析發現包含了PI3K/AKT信號通路在內的34個差異蛋白通路,發現左歸丸可回調高濃度葡萄糖導致的PI3K/AKT下調,其具體機制可能是被激活的AKT直接抑制FoxO1的活性后減少糖異生,而磷酸化GSK3可促進糖原合成,降低葡萄糖水平,起到預防糖尿病及相關疾病的作用[52-53]。上述研究發現,左歸丸激活PI3K/AKT信號通路,下調下游靶蛋白FoxO1表達抑制糖異生,磷酸化GSK3促進糖原合成,降低體內葡萄糖水平,發揮對糖尿病的防治作用。

2.4 骨科疾病骨質疏松癥的主要特征是骨量減少和骨組織微結構退化[54],屬于中醫學“骨痹”“骨痿”等范疇,陰陽失衡、腎精虧虛是發病的關鍵機制[55]。腎藏精,精生髓,髓生骨,腎精足則髓足,髓藏于骨內,髓足則骨強,精氣充足,骨髓得以充盈,為骨骼的生長、發育提供所需的營養,骨骼才能強健有力,因此治療骨質疏松癥可從補腎生髓入手[56]。

左歸丸填精益髓,對防治腎精不足所致的骨質疏松癥有效。趙軍等[57]研究證實,左歸丸整方可誘導大鼠骨髓間充質干細胞分化為成骨細胞、軟骨細胞等。基于中醫學“補腎壯骨”治法的理論基礎,黃勝男等[58]及范文斌等[59]運用網絡藥理學構建“活性成分-靶標-疾病”相互作用網絡分析具體機制,發現左歸丸可能通過包含PI3K/AKT通路在內的多靶點調控骨代謝平衡,并推測其激活AKT后抑制下游靶蛋白mTOR,誘導破骨細胞凋亡并抑制骨的吸收,促進成骨細胞增殖并抑制其分化,發揮對骨質疏松的治療作用。趙旭等[60]建立去卵巢所致骨質疏松癥大鼠模型,對左歸丸防治絕經后骨質疏松癥的分子機制進行探索,利用生物信息學分析方法觀察骨髓間充質干細胞基因表達譜變化,發現左歸丸通過PI3K/AKT信號通路對骨髓微環境發揮調節炎癥反應和免疫功能的作用,是防治該病的潛在靶標。Yin等[61]研究左歸丸對地塞米松誘導的斑馬魚幼體骨質疏松癥的保護作用,發現左歸丸可提高骨礦物質含量、增強骨生物力學、促進骨形成并抑制骨吸收,證明了左歸丸可能通過逆轉骨形成/骨吸收的不平衡和激活TGF-β/Smad信號來預防骨質疏松,而PI3K/AKT信號通路可通過AKT激酶依賴和獨立機制拮抗TGF-β/Smad信號通路,發揮預防骨質疏松的作用[41]。

綜上,左歸丸通過激活PI3K/AKT信號通路,抑制下游靶蛋白mTOR,調控TGF-β/Smad,促進成骨細胞增殖,誘導破骨細胞凋亡,調節骨形成/骨吸收過程,調節炎癥和免疫反應,發揮對骨質疏松的防治作用。

3 小結與展望

左歸丸主要是運用中醫“腎的精氣血虛衰為萬病之源”“腎主精生髓,通于腦”“腎藏精,主生殖”“腎精生髓,髓生骨”等理論將其與現代醫學的神經系統、生殖系統、內分泌系統、骨科疾病等聯系起來,通過滋陰益髓、溫壯腎陽、充補精血,發揮對疾病的防治作用。現階段,諸多學者對左歸丸進行多途徑、多靶點、多系統的深入研究,從分子水平揭示其藥理作用及對疾病的防治機制。在左歸丸基于PI3K/AKT信號通路防治相關疾病的分子機制研究中,多以動物及細胞模型作為主要研究對象,借助生物信息學及生命科學諸多技術,重點聚焦于PI3K/AKT信號通路下游Bcl-2、Bax、Caspase-3、GSK3β、mTOR、FoxO等靶蛋白,發現左歸丸主要發揮調節細胞周期,促進細胞代謝、生長及增殖,抑制細胞凋亡,調節氧化應激、炎癥反應及能量代謝,調控腫瘤細胞發生等生物學功能。以上基于信號通路及下游靶蛋白的深入系統研究,有利于對關于左歸丸臨床試驗的相關研究進行指導,并充分挖掘其臨床價值。

目前,關于左歸丸的基礎研究方面,缺乏其對PI3K/AKT信號通路上游靶點的調控作用,及其對信號通路關鍵蛋白AKT l、AKT 2和AKT 3三個不同亞型的精細化調控作用的相關研究,未來關于上述問題的深入研究,將有助于進一步精準揭示左歸丸對相關疾病防治的藥理作用及分子機制,以挖掘其更多的臨床使用價值。