腸桿菌科細(xì)菌mcr-1 流行病學(xué)研究

錢嬌 王怡嵐 洪加穩(wěn) 秦佳佳 王麗莎 厲世笑 許春燕 毛穩(wěn) 鄭淑芳 張嶸 余素飛

近年來，多重耐藥菌的檢出率在全球范圍快速增長(zhǎng)[1]，而抗生素的選擇極為有限，使得臨床抗感染治療面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，迫使臨床使用像多黏菌素和磷霉素等“老藥”。目前多黏菌素被認(rèn)為是治療碳青霉烯耐藥細(xì)菌所致嚴(yán)重感染的重要選擇[2-4]。但是隨著臨床應(yīng)用的增多，多黏菌素耐藥細(xì)菌也在不斷出現(xiàn)[5]。多黏菌素耐藥最主要的機(jī)制主要是染色體介導(dǎo)導(dǎo)致病原體脂質(zhì)A 的改變，從而降低對(duì)多黏菌素的親和力[5-6]，其傳播范圍和速度較為有限。自2015年Liu 等[7]在柳葉刀雜志首次報(bào)道了質(zhì)粒介導(dǎo)的多黏菌素耐藥基因（mobile co1istin resistance，mcr-1）后，mcr-1 在人類、食品、動(dòng)物和環(huán)境中的傳播和流行已被廣泛報(bào)道[8-9]。該基因即使沒有黏菌素的選擇性壓力，也可穩(wěn)定存在并廣泛傳播。更令人擔(dān)憂的是，同時(shí)攜帶mcr-1 和新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶Ⅰ型（New Delhi metallo-β-lactamase 1，NDM-1）的大腸埃希菌不斷有報(bào)道[10-12]，成為真正的“超級(jí)細(xì)菌”。本研究通過檢測(cè)mcr-1 在浙江省臺(tái)州醫(yī)院臨床分離得到的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中的流行情況，同時(shí)探討攜帶mcr-1 基因質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移能力及與其他耐藥基因共存的現(xiàn)象，為多重耐藥菌的防控工作提供理論依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 菌株來源 收集2018 年1 月至2022 年3 月浙江省臺(tái)州醫(yī)院臨床分離得到的非重復(fù)大腸埃希菌1 400株和肺炎克雷伯菌580 株，將菌株接種于中國藍(lán)平板，置于35 ℃孵箱孵育16～18 h，所有菌株均通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）（法國生物梅里埃公司）進(jìn)行菌種鑒定。菌株來源于臨床各類標(biāo)本，其中尿液706 例，分泌物604 例，全血496 例，呼吸道132 例，無菌體液22 例，糞便15 例，其他標(biāo)本類型5 例。

1.2 主要儀器和試劑 中國藍(lán)平板（杭州濱和微生物試劑有限公司）；腦心浸液肉湯（brain heart infusion broth，BHI）、MH 肉湯和瓊脂（英國OXOID 公司）；微量肉湯稀釋法藥敏板（溫州市康泰生物科技有限公司）；PCR 擴(kuò)增試劑及DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)（日本TaKaRa 公司）；核酸電泳瓊脂糖（上海生工生物技術(shù)有限公司）；紫外成像系統(tǒng)（德國Whatman Biometra 公司）；TIANGEN 細(xì)菌基因組DNA 試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]。

1.3 PCR 檢測(cè)mcr-1 制備細(xì)菌DNA 模板，參照文獻(xiàn)[1]合成引物序列（mcr-1-F：5'-CGGTCAGTCCGTTTGTTC-3'；mcr-1-R：5'-CTTGGTCGGTCTGTAGGG-3'）。PCR 總反應(yīng)體系50 μL，包括待測(cè)菌DNA 模板3 μL、15 U/μL TaqDNA 聚合酶0.25 μL、10×PCR buffer 5 μL、5 mmol/L dNTP mixture 4 μL、25 μmol/L 下游引物1 μL、25 μmol/L 下游引物1 μL、ddH2O 35.75 μL。反應(yīng)條件：94 ℃變性1 min；50 ℃退火1 min；72 ℃延伸50 s。PCR 產(chǎn)物在1% 普通瓊脂糖凝膠上電泳，150 V 恒壓電泳15 min，紫外成像系統(tǒng)觀察分析電泳條帶。與mcr-1陽性質(zhì)控在同一位置出現(xiàn)電泳條帶判斷為mcr-1 陽性。

1.4 抗生素敏感性試驗(yàn) mcr-1 陽性菌株采樣E-test法檢測(cè)多黏菌素最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），其余抗生素采用微量肉湯稀釋法。多黏菌素藥敏結(jié)果判斷參考?xì)W盟藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST）標(biāo)準(zhǔn)：S≤2 mg/L，R≥4 mg/L。其他抗生素藥敏結(jié)果判斷折點(diǎn)參考美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2022 年M100 文件中腸桿菌目細(xì)菌抑菌圈直徑和MIC 折點(diǎn)。

1.5 接合試驗(yàn) 采用肉湯法。mcr-1 陽性菌株為供體菌，利福平耐藥大腸埃希菌（EC600）為受體菌。供體菌和受體菌在BHI 37 ℃、200 r/min 下過夜培養(yǎng)，分別取200 μL 過夜培養(yǎng)的供體菌和受體菌菌液至新鮮的2 mL BHI，37 ℃200 r/min 培養(yǎng)4 h，使之到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取供體菌與受體菌新鮮菌液，將OD600 值調(diào)整至0.5 麥?zhǔn)蠞岫龋环謩e取供體菌與受體菌各600 μL混合至2 mL 離心管，4 000 r/min、5 min 收集菌體（沉淀部分），棄上清液，用新鮮6 mL 含有0.5 μg/mL 多黏菌素的BHI 重懸菌體。隨后在37 ℃孵箱靜置過夜孵育。吸取100 μL 上述過夜培養(yǎng)的混合菌液均勻涂布到篩選平板（含1.5 μg/mL 多黏菌素和600 μL/mL利福平），用混合前供體菌和受體菌作為空白對(duì)照，37 ℃孵箱過夜孵育將上述篩選平板上單菌落細(xì)菌轉(zhuǎn)劃到另一篩選平板上，再次孵育并對(duì)接合子作耐藥基因和藥敏鑒定。

1.6 全基因組測(cè)序（whole genome sequencing，WGS）挑取mcr-1 陽性菌株新鮮菌落，按照TIANGEN 細(xì)菌基因組DNA 試劑盒說明書提取基因組。經(jīng)DNA 文庫構(gòu)建后在Illumina nova-seq 6000 平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序下機(jī)的數(shù)據(jù)經(jīng)過處理后DNA 信息儲(chǔ)存于FASTQ 格式的文件中。在Linnux 系統(tǒng)下采用SPAdes-3.0 軟件進(jìn)行序列拼接。組裝后的基因組序列在基因組流行病學(xué)中心（Center for Genomic Epidemiology, CGE）網(wǎng)站（http：//www.genomicepidemiology.org/）上進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST）、質(zhì)粒Inc 分型和耐藥基因識(shí)別等分析。

2 結(jié)果

2.1 mcr-1 檢測(cè)結(jié)果 對(duì)收集到的所有腸桿菌科細(xì)菌進(jìn)行mcr-1 基因篩查，在1 400 株大腸埃希菌中，共檢測(cè)出6 株攜帶mcr-1，陽性率為0.43%；580 株肺炎克雷伯菌，僅1 株檢出mcr-1，陽性率0.17%，陽性菌株P(guān)CR電泳結(jié)果見圖1。

圖1 mcr-1 陽性PCR 擴(kuò)增電泳圖

2.2 mcr-1 陽性菌株藥敏試驗(yàn) 7 株細(xì)菌對(duì)多黏菌素B 的MIC 范圍為1、2、4 g/L。具體藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表1，其中ECO1022 是耐碳青霉烯大腸埃希菌。

表1 mcr-1 陽性菌株及接合子藥敏（μg/mL）

2.3 接合試驗(yàn) ECO910 的MIC 是1 mg/L，未進(jìn)行接合試驗(yàn)。其余6 株菌株成功接合5 株，ECO1022 沒有接合成功。接合子對(duì)多黏菌素B 的MIC 值在1～2 mg/L，較原始菌株有下降。mcr-1 陽性菌株及接合子藥敏信息見表1。

2.4 全基因組測(cè)序結(jié)果分析 7 株細(xì)菌（6 株大腸埃希菌，1 株肺炎克雷伯菌）經(jīng)過二代測(cè)序及拼接后得到約5 Mb 的全基因組序列。MLST 結(jié)果顯示6 株大腸埃希菌屬于不同的ST 型，分別是ST648、ST95、ST359、ST602、ST453、ST156，肺炎克雷伯菌為ST25。耐藥基因分析發(fā)現(xiàn)7 株細(xì)菌攜帶大量的耐藥基因，除了攜帶介導(dǎo)mcr-1 耐藥基因外，還攜帶介導(dǎo)β 內(nèi)酰胺類（blaCTX-M、blaTEM、blaCMY、blaSHV、blaLAP、blaOXA、blaVIM-48、blaNDM-5）、磷霉素（fosA）、喹諾酮類[oqxAB，qnrS1 和aac（6'）-Ib-cr]、四環(huán)素類[tet（A）]、氯霉素類（floR，cmlA 和catA2）、大環(huán)內(nèi)酯類[mph（A），mdf（A）和erm（B）]、甲氧芐啶（dfrA）、磺胺類（sul）、利福平（ARR）和氨基糖苷類（aac、aad、aph 和arm）10 種不同種類的抗菌藥物耐藥，見表2。其中1 株大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌同時(shí)攜帶臨床上被認(rèn)為最后用于治療多重耐藥的陰性桿菌的抗菌藥物的耐藥基因：碳青霉烯耐藥基因（blaNDM-5、blaOXA-10、blaVIM-48）和mcr-1。

表2 7株細(xì)菌的基本情況

7 株細(xì)菌的mcr-1 基因所在的片段長(zhǎng)度在4 450～63 861 bp。片段所在的質(zhì)粒類型有IncX4（2 個(gè)）和IncI2（4 個(gè)），還有1 株由于mcr-1 基因所在片段長(zhǎng)度短，尚且不知道m(xù)cr-1 基因所在的位置。IncX4、IncI2 是mcr-1 基因所在的常見質(zhì)粒類型。本研究中4 個(gè)IncI2類型的質(zhì)粒序列與分離自國內(nèi)安徽巢湖的大腸埃希菌pAH62-1（GenBank 序列號(hào)CP055260）高度相似，見圖2（插頁）；而另2 個(gè)IncX4 類型的質(zhì)粒則與分離自埃及的大腸埃希菌pCFSAN061769_01（GenBank 序列號(hào)CP042970）高度相似，見圖3（插頁），提示攜帶mcr-1相同質(zhì)粒在大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌之間的傳播。

圖2 4 株細(xì)菌mcr-1 基因所在IncI2 質(zhì)粒序列的比較圖

圖3 2 株細(xì)菌mcr-1 基因所在IncX4 質(zhì)粒序列的比較圖

3 討論

由于多黏菌素類藥物對(duì)人體有腎毒性和神經(jīng)毒性，所以在20 世紀(jì)后期，臨床應(yīng)用逐漸減少。而在養(yǎng)殖業(yè)中該類藥物被大量應(yīng)用于禽畜的疾病預(yù)防，但其耐藥性一直保持較低水平。2015 年，我國學(xué)者在動(dòng)物來源的大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)mcr-1，并驗(yàn)證了其水平傳播能力，解釋了近年來多黏菌素耐藥率激增的現(xiàn)象。這一發(fā)現(xiàn)引發(fā)了全球研究mcr-1 的熱潮。有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因廣泛流行，不僅存在于動(dòng)物和人體內(nèi)，在環(huán)境中也有發(fā)現(xiàn)[13-15]，而且動(dòng)物源、動(dòng)物性食物源標(biāo)本中mcr- 1 檢出率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于人源標(biāo)本（0.63% ～37.50%）[7，9，16]。盡管目前在臨床感染患者的檢出率在0.30%～1.65%之間[7，17-19]。但基于“One Health”理念，地球生物圈的健康是相輔相成且無法相互分割的。而且現(xiàn)階段，多黏菌素作為多重耐藥菌治療的有效藥物被重新啟用，有必要擔(dān)心其在臨床實(shí)踐中耐藥性增加的問題，所以對(duì)mcr-1 的流行情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)十分必要。

本研究得到浙江省臺(tái)州醫(yī)院臨床分離的大腸埃希菌mcr-1 檢出率是0.43%，肺炎克雷伯菌是0.17%，與研究報(bào)道一致。所有患者均無多黏菌素暴露史，其中1 例是門診兒童患者。6 株mcr-1 陽性大腸埃希菌屬于不同ST 型，說明浙江省臺(tái)州醫(yī)院分離得到mcr-1的大腸埃希菌不是同一克隆來源。本研究沒有檢測(cè)到ST131 型，但作為大腸埃希菌最主要克隆流行株，mcr-1 在大腸埃希菌中傳播只是時(shí)間問題[20]。此外，有1 株大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的mcr-1 所在質(zhì)粒類型是IncX4，兩者非常相似，提示攜帶相同質(zhì)粒可以在不同菌種之間傳播。目前為止，已報(bào)道多種mcr 基因突變體[8，21]，且質(zhì)粒種類多樣，隨著臨床上多黏菌素的應(yīng)用在不斷增加，在相應(yīng)的選擇壓力下，mcr 陽性菌株可能也會(huì)造成新一波的流行。

雖然mcr-1 主要介導(dǎo)低水平耐藥，但mcr-1 可以與不同的耐藥基因整合于同一個(gè)轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒上。本研究分離到的菌株多黏菌素MIC 值為1～4 mg/L，但攜帶大量耐藥基因。盡管本研究中耐碳青霉烯大腸埃希菌ECO1022 接合試驗(yàn)沒有成功，但已有來源于不同供體的blaNDM-5與mcr-1 共轉(zhuǎn)移到同一受體菌的報(bào)道[22]。本研究分離得到的肺炎克雷伯菌（blaOXA-10和blaVIM-48）分離自血液，但因其抗生素還是敏感居多，對(duì)患者預(yù)后沒有產(chǎn)生嚴(yán)重影響。而攜帶blaNDM-5大腸埃希菌來源于糞便，臨床考慮是腸道定植未作處理，但腸道是耐藥基因的儲(chǔ)存庫,是臨床抗感染治療的一大隱患。

綜上所述，mcr-1 在浙江省臺(tái)州醫(yī)院大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中分離率較低，且為散在分布。但是，由于攜帶mcr-1 的質(zhì)粒可在不同菌種間水平傳播，而且mcr-1 可以與多種耐藥基因整合在同一質(zhì)粒，尤其是與碳青霉烯類耐藥基因共存，提示臨床需要加強(qiáng)對(duì)多重耐藥菌的管理。