樂清地區(qū)308株非結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定、分布及耐藥情況研究

林雪峰 陳靜 江丹英 王兵勇 南汝潔 張芳義 鄭愛潔 翁吉仁

非結(jié)核分枝桿菌（nontuberculous Mycobacteria，NTM）是除了結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌和麻風(fēng)分枝桿菌等以外的分枝桿菌[1]。對常用的抗結(jié)核藥物耐受，是條件致病菌[2]。NTM 可侵犯人體各種器官和組織，但主要引起肺部感染[3]，其致病過程和臨床表現(xiàn)與肺結(jié)核極為相似，且又多見于原發(fā)慢性肺部疾病愈后患者，故未進行NTM 分離培養(yǎng)及鑒定時，常被誤診為肺結(jié)核病[4]。多項研究表明，NTM 的類型分布具有地域差異性[5]。不同區(qū)域的NTM 菌種類型、分布及耐藥情況均有不同的特點[6]。因此，對特定地區(qū)的NTM 菌種鑒定、分布與耐藥情況進行系統(tǒng)研究與分析對于NTM 的臨床治療非常有意義。筆者對樂清市人民醫(yī)院分離得到的308 株NTM 進行菌種鑒定、分布及耐藥情況研究，以期為NTM 臨床診療提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，提高樂清地區(qū)NTM 的精準(zhǔn)診療水平。

1 對象和方法

1.1 菌種來源 收集2018 年1 月至2022 年12 月在樂清市人民醫(yī)院入院患者的痰、肺泡灌洗液、創(chuàng)口分泌物、肺穿刺組織和胸水等臨床標(biāo)本18 006 份（一次入院僅統(tǒng)計首次送檢標(biāo)本）。采用BD MGIT960 System（簡稱MGIT960）對痰、肺泡灌洗液、創(chuàng)口分泌物等標(biāo)本進行分枝桿菌培養(yǎng)，采用BD Bactec FX 對肺穿刺組織、胸水等標(biāo)本進行分枝桿菌培養(yǎng)，共分離分枝桿菌1 770 株，分枝桿菌檢出率為9.8%（1 770/18 006），經(jīng)MPB64 抗原檢測和質(zhì)譜鑒定其中308 株為NTM，NTM檢出率為17.4%（308/1 770）。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查通過（批準(zhǔn)文號：YQYY202300200）。

1.2 儀器與試劑 MPB64 抗原檢測試劑盒（膠體金法）購自杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)公司。質(zhì)譜檢測使用Bruker MicroflexTM質(zhì)譜儀進行。藥敏板條采用賽默飛的NTM 藥敏板條。

1.3 菌種鑒定 臨床分離的NTM 菌株，以70%乙醇滅活菌體，0.1 mm 玻璃珠裂解細(xì)胞，甲酸和乙晴提取蛋白后，采用Bruker MicroflexTM質(zhì)譜儀檢測。如鑒定分值＜2.0，則采用16S rRNA 測序鑒定。鑒定的NTM 菌株根據(jù)生長速率又區(qū)分為快生長NTM 或慢生長NTM（在固體培養(yǎng)基上7 d 內(nèi)形成成熟菌落者為快生長NTM，反之為慢生長NTM）[7]。

1.4 藥敏檢測 根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）M24 標(biāo)準(zhǔn)，采用微量肉湯稀釋法對其中的152 株菌進行藥敏試驗。按照說明書，制備0.5 麥?zhǔn)暇鷳乙海瑢?00 μL 菌懸液加入MH 肉湯中稀釋200 倍，其中慢生長NTM 菌株需要在肉湯中加入油酸清蛋白葡萄糖過氧化氫酶添加劑（oleic albumin dextrose and catalase medium，OADC），每孔接種量為100 μL，根據(jù)CLSI M24 標(biāo)準(zhǔn)推薦的溫度孵育，讀取最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），根據(jù)折點判讀結(jié)果為敏感、中介或耐藥。匯總藥敏結(jié)果，計算抑制50%菌株生長的MIC（MIC50）和抑制90%菌株生長的MIC（MIC90）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 308 株NTM 來源及感染患者的性別、年齡分布情況 308 株NTM 中從痰培養(yǎng)中分離得到191 株（占62.1%），從肺泡灌洗液中分離得到105 株（占34.1%），從分泌物中分離得到10 株（占3.2%），從肺穿刺組織中分離得到2 株（占0.6%）。308 株NTM 中來自女性患者有209 株（67.6%），來自男性患者有99 株（32.4%）。其中，≥50～＜70 歲患者最多，其次是≥70～＜90 歲患者，5 個不同年齡分組患者性別分布的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 308例NTM感染患者的性別與年齡分布[株（%）]

2.2 各NTM 種類在不同性別患者中的分布 共檢測出19 種NTM，其中13 種為慢生長NTM（248 株），6 種為快生長NTM（60 株）。以胞內(nèi)分枝桿菌184 株（59.7%）為主，男女占比分別為30.4%（56/184）和69.6%（128/184），膿腫分枝桿菌45 株（14.6%）為次，男女占比分別為24.4%（11/45）和75.6%（34/45），隨后分別為鳥分枝桿菌17 株（5.5%），馬賽分枝桿菌9 株（2.9%），海分枝桿菌9 株（2.9%），堪薩斯分枝桿菌6 株（1.9%）。男女不同性別患者的菌種分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），見表2。

表2 各NTM種類在不同性別患者中的分布[株（%）]

2.3 各NTM 種類在不同年齡患者中的分布 308 株中來自≥10～＜30歲患者的菌種有14株（4.5%），≥30～＜50歲有48株（15.5%），≥50～＜70 歲有163 株（52.8%），≥70～＜90 歲有80 株（25.9%），≥90 歲有3 株（1.0%），5 組不同年齡患者的菌種分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），見表3。

表3 各NTM種類在不同年齡患者中的分布[株（%）]

2.4 NTM 的耐藥情況

2.4.1 慢生長NTM 的耐藥情況 本研究對90 株胞內(nèi)分枝桿菌進行抗菌藥物敏感性試驗，發(fā)現(xiàn)對克拉霉素和阿米卡星有較好的敏感性，敏感率均為95.6%，耐藥率均低于3.0%。而對利奈唑胺和莫西沙星的耐藥程度非常高，耐藥率均高于50.0%，見表4。

表4 慢生長NTM中胞內(nèi)分枝桿菌對抗菌藥物的敏感性

行藥敏檢測的13 株鳥分枝桿菌對阿米卡星的耐藥率較低，僅為7.7%。對克拉霉素、利奈唑胺和莫西沙星則具備一定的敏感性和耐藥性，見表5。

表5 慢生長NTM中鳥分枝桿菌對抗菌藥物的敏感性

對于行藥敏檢測的除鳥-胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群（Mycobacterium Avium-Intracellulare complex，MAC）外的19 株其他慢生長NTM，克拉霉素、利福平、阿米卡星、利福布汀有較好的敏感性，敏感率均大于78.0%，見表6。

表6 慢生長NTM中除MAC外其他分枝桿菌對抗菌藥物的敏感性

2.4.2 快生長NTM 的耐藥結(jié)果 行藥敏檢測的20 株膿腫分枝桿菌對阿米卡星、克拉霉素的敏感性較好，敏感率分別為100.0%和70.0%；對多西環(huán)素、莫西沙星、環(huán)丙沙星和復(fù)方新諾明，耐藥率均為100.0%；對亞胺培南和妥布霉素的耐藥率均為70.0%，見表7。

表7 快生長NTM中膿腫分枝桿菌對抗菌藥物的敏感性

行藥敏檢測的除膿腫分枝桿菌外的10 株其他快生長NTM，僅阿米卡星有較好的敏感性，敏感率為80.0%。對亞胺培南、妥布霉素、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星和復(fù)方新諾明，耐藥率≥80.0%，見表8。

表8 快生長NTM中除膿腫分枝桿菌外其他分枝桿菌對抗菌藥物的敏感性

3 討論

近年來，NTM 呈快速增多趨勢，已成為威脅人類健康的重要公共衛(wèi)生問題之一，受到廣泛關(guān)注。歷次全國流行病學(xué)調(diào)查顯示，NTM 感染率從1990 年的4.3%升至2000 年的11.1%，直至2010 年的22.9%，NTM感染性疾病的發(fā)病率不斷增高[8]。從總趨勢來看，南方高于北方，沿海地區(qū)高于內(nèi)陸地區(qū)，并且NTM 由于與結(jié)核分枝桿菌有部分交叉抗原，因此大部分的抗結(jié)核藥物對NTM 均無明顯活性[9]。治療困難，預(yù)后差，故NTM 感染性疾病成為臨床難點之一[10]。對不同地區(qū)NTM 進行菌種鑒定、分布趨勢及耐藥情況的系統(tǒng)研究則非常有必要[11]。根據(jù)該地區(qū)NTM 特定的分布趨勢及耐藥情況分析可以為臨床提供精準(zhǔn)用藥的提示，有效減少抗菌藥耐藥所帶來的困擾[12]。

當(dāng)前在NTM 臨床診斷中，痰液、肺泡灌洗液等呼吸道標(biāo)本成為主要依據(jù)。本研究共檢出308 株菌株，涵蓋19 種NTM 菌種。樣本分布也是以痰液和肺泡灌洗液為主，占比96.1%。本地區(qū)的NTM 以胞內(nèi)分枝桿菌和膿腫分枝桿菌為主，共分離出229 例（74.3%）。這與廣州地區(qū)報道的菌種分布情況相一致。廣州地區(qū)報道4 年間NTM 菌種分布前3 位的為鳥-胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合菌（36.01%）、龜-膿腫分枝桿菌（34.22%）、堪薩斯分枝桿菌（7.89%）[13]。這可能與兩地的地域環(huán)境類似有關(guān)，均屬于沿海省份，空氣濕度相對較大，菌種分布類似。另外，本研究發(fā)現(xiàn)NTM 感染患者中，女性患者明顯高于男性患者，尤其是在中老年人（≥50～＜70歲）中，女性占比（77.9%）遠(yuǎn)大于男性（22.1%），這與其他地區(qū)的研究結(jié)果并不一致。從年齡分布上來看，中老年人（50～70 歲）也是感染的主力軍（52.8%）。在≥50～＜70 歲組感染率最高的菌種是胞內(nèi)分枝桿菌（68.1%）和膿腫分枝桿菌（14.7%）。考慮與中老年女性人群潛在的免疫功能下降有關(guān)，從而更容易感染NTM。此外，針對胞內(nèi)分枝桿菌的耐藥性分析顯示，本地區(qū)的胞內(nèi)分枝桿菌對克拉霉素和阿米卡星有較好的敏感性，敏感率均為95.6%，耐藥率均低于3.0%。而對利奈唑胺和莫西沙星的耐藥程度非常高，耐藥率均高于50.0%。這與平頂山地區(qū)的耐藥情況也不一樣，該地區(qū)報道胞內(nèi)分枝桿菌對克拉霉素、阿米卡星的耐藥率高于70.0%[14]。針對鳥分枝桿菌的耐藥性分析顯示，鳥分枝桿菌對阿米卡星的耐藥率較低，僅為7.7%。對克拉霉素、利奈唑胺和莫西沙星則具備一定的敏感性和耐藥性。而平頂山地區(qū)報道的鳥分枝桿菌對阿米卡星、克拉霉素、利奈唑胺和莫西沙星耐藥性可達60%以上[14]。平頂山市處于暖溫帶和亞熱帶氣候交錯的邊緣地區(qū)，具有明顯的過渡性特征，四季分明，氣候溫和[15]。本地區(qū)屬中亞熱帶海洋型季風(fēng)氣候，降水量受地域地形差異、季風(fēng)和海流的影響變化很大[16]。

有必要指出的是，臨床在進行NTM 感染治療時，應(yīng)當(dāng)對NTM 的菌種進行系統(tǒng)的鑒定和耐藥性分析。根據(jù)分析結(jié)果及時進行用藥方案的調(diào)整。有效的藥物治療方案應(yīng)當(dāng)不僅限于一種藥物，與多種藥物的聯(lián)合使用或許可以提高藥物的抗菌效果，同時減少耐藥性的不斷積累，降低耐藥性[17]。

綜上所述，本文報道了樂清市人民醫(yī)院NTM 的菌種分布和耐藥性分析，以期為本地區(qū)的NTM 感染精準(zhǔn)治療提供研究基礎(chǔ)。本研究分離出的NTM 以胞內(nèi)分枝桿菌、膿腫分枝桿菌和鳥分枝桿菌為主，且對阿米卡星、克拉霉素具有高度敏感性，對多西環(huán)素高度耐藥。研究結(jié)果具備一定的地域特異性，提示臨床對NTM 感染的藥物治療應(yīng)當(dāng)基于當(dāng)?shù)氐木N分布及耐藥性特色，有效地鑒別分枝桿菌類型，及時進行藥敏測試，合理制定藥物治療方案。