萬年縣古稻原產區細菌多樣性分析及功能預測*

劉亞軍 ,汪成缽 ,章 濤 ,葉 翠 ,儲小東 ,廖文成 ,李榮富,吳永明**

(1.江西省科學院微生物研究所 南昌 330096;2.江西省煤田地質勘察研究院 南昌 330001)

水稻(Oryza sativa)是我國主要的糧食作物,為提高作物產量,農藥和化肥被大量施用,嚴重威脅著農業的可持續化發展[1-2]。萬年貢谷原名“塢源早”,是一種人工栽培的野生稻,起源于南北朝時期,以江西省萬年縣裴梅鎮荷橋村最為正宗。受當地獨特水土環境的影響,加之采用傳統環境友好的耕作方式,保證了萬年貢谷優良品質,富含蛋白質、維生素B和多種有益微量元素[3]。然而,目前關于萬年貢谷原產區土壤環境特異性的研究較為缺乏。

萬年縣古稻原產區主要分布在裴梅鎮一帶,地處珠溪河上游、懷玉山北麓的丘陵峽谷地帶,稻田土壤常年溫度在15 ℃左右,富含N、P、K 及Cu 等元素,形成貢谷生長得天獨厚的自然環境。此外,古稻生長周期180 d 左右,為保證作物產品質量,當地堅持施撒有機肥和人工去除雜草等低強度管理措施,從而有效地保護了當地的土壤環境。同樣位于珠溪河流域的鄰近區域稻田,多采用現代農田管理方式,大量使用化肥和農藥。大量的研究發現,差異化的管理措施不僅會影響土壤的養分狀況,還會影響土壤 的結構特征[4-5]。微生物作為農田生態系統的一部分,參與了幾乎所有的土壤過程,其催化的養分循環直接關系到作物的產量和質量[6]。同時,微生物對土壤環境變化極度敏感,能夠很好地指示土壤生態系統功能的改變[7]。因而,關于農田系統微生物的研究越來越受到重視。長期施肥不僅提高了耕地土壤微生物的豐度,還能夠改變微生物的組成類群[8]。化肥和農藥的過量施用則會顯著改變N 循環相關功能菌群,包括硝化、反硝化和厭氧氨氧化古菌/細菌,從而對農田生態系統產生不利的影響[9]。考慮到微生物的重要性,通過調節和控制地下生物過程可作為提高水稻產量和減少肥料對環境不利影響的一種策略,從而有助于農田生態系統的可持續性發展。有研究發現,平衡施肥能夠維持水稻土微生物群落多樣性特征,可能有助于提高土壤肥力和水稻產量[10]。然而,土壤質量變化是一個緩慢的過程[11],同時微生物群落結構的穩定也需要一定的時間[12]。因此,研究長期、無間斷健康管理下古稻種植區的土壤微生物群落及其功能特征,不僅可以明晰古稻原產區土壤微生態環境的特異性,為貢米的推廣種植提供理論依據,同時對于規范水田管理措施也至關重要。

據此,本研究以古稻原產區(江西省萬年縣裴梅鎮)及其周邊區域常規稻田土壤為研究對象,分析水稻土壤物化性質、微生物群落結構及其功能潛力,探求古稻原產區土壤微生態環境特征,為農田環境監測、生態治理及創建生態友好型水稻種植模式提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 研究區域概況

萬年縣地處江西省東北中部(圖1),屬亞熱帶季風濕潤氣候,年均氣溫17.5 ℃,年均無霜期為260 d,年均降水量為1908.4 mm。萬年縣是一個典型的特色農業縣,素有“南方古稻米之鄉”和“中國貢米之鄉”等美譽。萬年貢米原產區集中在裴梅鎮,位于懷玉山北麓的丘陵峽谷地帶,土壤屬偏酸性黏土,獨特的水土環境和優化的田間管理方式是保持萬年貢米高質量的保障。鄰近區域包括上坊鄉和珠田鄉,均位于樂安河支流—珠溪河匯集區內。

圖1 研究區域及樣點分布圖Fig.1 Locations of study area and sampling sites

1.2 樣品采集及處理

通過文獻資料和實地勘察,依據當地地形地貌、水系特征,共采集6 個研究區域的稻田土壤,包括:珠田鄉北(ZTN)、珠田鄉南(ZTS)、上坊鄉東(SFE)、上坊鄉西(SFW)、裴梅鎮東(PME)和裴梅鎮西(PMW)。珠田鄉、上坊鄉和朱田鎮分別位于珠溪河下游、中上游和上游。PMW 為古稻種植區,采用傳統耕作方式,包括施撒有機肥和人工雜草清理;其他研究區域多采用現代耕作方式,化肥和農藥使用量較大。為了更好地表征農田土壤狀況,降低田間水肥管理短暫的影響和干擾,于水稻移栽前(2023 年2 月),在每個區域設置5 個采樣點(間距＞2 km),每個采樣點采用梅花法(間距＞20 m)進行耕層土壤(0～20 cm)樣品采集,共獲得30 個混合樣品。土樣低溫運至實驗室,剔除殘留的枯枝落葉和石礫后分裝兩份,一份自然風干后用于土壤理化性質的測定,另一份保存在-80 ℃,用于DNA 提取。

1.3 土壤基礎物化參數測定

稻田土壤基礎理化性質的測定均采用常規方法[13]。具體而言,含水量(SM)采用烘干差重法,pH(水土比v∶w=2.5∶1)采用電位法,陽離子交換量(CEC)采用乙酸銨交換-蒸餾滴定法,總有機質(OM)采用重鉻酸鉀外加熱法,總氮(TN)和有效氮(AN)采用微量凱氏定氮法,總磷(TP)采用釩鉬黃分光光度法,有效磷(AP)采用聯合浸提-比色法,有效鉀(AK)采用乙酸銨提取-火焰光度法,金屬元素(Cd、Cr、Pb、Zn、Cu、Hg、Ni 和As)均采用電感耦合等離子體質譜法測定。

1.4 DNA 提取及高通量測序及分析

稱取保存于-80 ℃冰箱的土壤樣品0.25 g,使用MOBIO 的強力土壤DNA 提取試劑盒(PowerSoil?DNA Isolation Kit)提取土壤微生物總DNA。采用分光光度計(NanoDrop2000TM;ThermoScientific Inc,West Palm Beach,FL)和瓊脂糖凝膠電泳技術檢測DNA 的濃度、純度和完整度。基于熒光定量PCR 技術測定16S rRNA 基因豐度(目的基因為16S ITS)。此外,將檢測合格的DNA 樣品于干冰上運送至上海美吉生物醫藥科技有限公司,由Illumina Miseq PE300 測序平臺進行高通量測序。選擇通用引物338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)/806R(5′ -GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)擴增細菌16S rRNA 的V3-V4 高變區。測序原始序列經質控、拼接、篩選、去除嵌合體等步驟獲得的有效序列進行物種注釋等后續信息學分析。而后使用FAPROTAX 程序預測了群落的功能潛力[14]。FAPROTAX 是一個人工構建的數據庫,根據文獻中的培養記錄將原核生物物種(如屬或種)映射到假定的功能。

1.5 數據處理

本文相關數據的整理及統計分析均通過R 語言(https://www.r-project.org/)完成。使用ggpubur 包(0.4)進行單因素方差分析以及Tukey 事后多重比較檢驗了組間土壤物化因子及細菌群落組成差異的顯著性;使用vegan 包進行了mantel、PERMONOVA 檢驗。基于Bray-Curtis 距離的主坐標分析(PCoA),使用Vegan 包展示細菌群落結構的概況。通過Mantel 相關分析探究土壤環境因子和細菌群落的關系。

2 結果與分析

2.1 古稻原產區土壤物化性質分析

為更好地表征稻田土壤物化性質,測定分析了土壤粒度、養分以及重金屬元素分布特征(表1)。結果發現,相較于其他研究區域,古稻原產區(PMW)稻田土壤富含更高含量的TN (2.41 g·kg-1)和更低含量的Zn (64.60 mg·kg-1)。此外,還發現PMW 的AN(289.57 mg·kg-1)和Cu (57.6 mg·kg-1)含量高于其他研究區域。對于威脅當地水稻安全種植的重要污染物Cd,含量最高的區域是普通稻產區[ZTN (0.27 mg·kg-1)和SFW (0.27 mg·kg-1)]。同時,土壤的其他參數(pH、CEC、OM、TP、AK、AP、Cr、Pb、Hg、Ni 和As)并未表現出明顯的空間分布差異。

表1 不同研究區域土壤理化指標Table 1 Physicochemical parameters of soil samples from different regions

2.2 古稻原產區細菌群落結構特征

對研究區域30 個土壤DNA 樣品進行擴增子測序分析,平均覆蓋度高達95.25%,表明測序結果能夠很好地表征細菌群落特征。經質量控制和聚類(97%相似性)分析,共劃分出14 767 個操作類單元(OTU),注釋獲得51 個門(Phylum)、155 個綱(Class)、334 個目(Order)、506 個科(Family)和891 個屬(Genus)。研究表明,細菌豐度(基于16S rDNA 基因拷貝數)及Alpha 多樣性(包括ACE、Chao1、Shannon、Simpson 和PD_whole_tree)均未表現出明顯的空間分布差異(表2)。

表2 不同研究區域細菌群落豐度及多樣性Table 2 Bacterial community abundance and diversity of soil samples from different regions

基于OTU 水平對細菌群落進行主坐標分析(PCoA),發現古稻原產區(PMW)的5 個樣點緊密地聚為一簇(圖2a),與其鄰近的是PME 和SFW 組,而ZTN、ZTS 和SFW 則較為分散,在第一軸上多分布于PMW 的左側。組間差異分析(Adonis)發現(圖2b),6 個區域內耕地土壤細菌群落組成存在顯著差異(R2=0.243,P＜0.001),同時PMW 細菌群落具有明顯的特異性,不同于其他研究區域(P＜0.05)。總體來看,PME (R2=0.173,P=0.006)和SFW (R2=0.159,P=0.007)與PMW 最為接近,其次是ZTS (R2=0.177,P=0.011),SFE (R2=0.228,P=0.017)和ZTN (R2=0.227,P=0.009)相差最大。組內差異分析(基于Bray-curtis 距離)發現(圖2c),PMW 組內差異顯著小于附近普通稻產區(P＜0.05)。結合各研究區域的分布特征(圖1),空間距離可能是影響細菌群落演替的重要因素。

圖2 不同研究區域水稻土細菌群落的基于OTU 水平的主坐標分析(a)、基于Adonis 的研究組間差異分析(b)和基于Bray-curtis 距離的組內差異分析(c)Fig.2 Ordination of paddy soil bacterial communities via principal coordinate analysis (PCoA) at the OTU level (a),analysis of inter-groups differences of paddy soil bacterial communities based on Adonis (b),and analysis of intra-groups differences of soil bacterial communities based on Bray-curtis distances (c) in different regions

研究區域內的優勢細菌門(＞1%)共有13 個(圖3),包括變形菌門(Proteobacteria,22.17%)、綠彎菌門(Chloroflexi,19.31%)、酸桿菌 門(Acidobacteriota,16.95%)、放線菌門(Actinobacteriota,13.46%)、厚壁菌門(Firmicutes,4.60%)、粘菌門(Myxococcota,3.20%)、脫硫桿菌門(Desulfobacterota,2.95%)、硝化螺旋菌門(Nitrospirota,2.63%)、浮霉菌門(Planctomycetota,2.14%)、擬桿菌 門(Bacteroidota,2.13%)、芽單胞 菌門 (Gemmatimonadota,1.34%)、Methylomirabilota(1.14%)和藍細菌門(Cyanobacteria,1.13%)。古稻原產區(PMW)富集了更多的厚壁菌門(5.80%)和擬桿菌門(2.98%);同時表現出更低相對豐度的酸桿菌門(13.83%)和硝化螺旋菌門(2.24%) (P＜0.05)。此外,對于25 個優勢細菌屬(＞1%),相較于其他研究區域,PMW 表現出更高相對豐度的黃色桿菌科未分類屬(Xanthobacteraceae_unclassified,3.44%)、康奈斯氏桿菌屬(Conexibacter,1.79%)和甲基孢囊菌屬(Methylocystis,1.83%);以及更低豐度的酸桿菌目未分類屬(Acidobacteriales_norank,3.09%)、Thermodesulfovibrionia_norank (1.37%)、Candidatus_Solibacter(0.08%)、Bryobacter(0.88%)和全噬菌綱未分類屬(Holophagae_Subgroup_7_norank,0.88%),但差異性均不顯著。

圖3 不同研究區域水稻土壤優勢(＞1%)細菌門(a)和屬(b)水平的相對豐度Fig.3 Relative abundances of soil bacterial communities of paddy in different regions at dominant (＞1%) phylum (a) and genus (b)levels in different regions

2.3 古稻原產區細菌群落功能潛力分析

為進一步獲取細菌群落的功能信息,通過FAPROTAX 對菌群進行功能預測(圖4)。共獲得61項功能分組,其中與化能異養、好氧化能異養和固氮作用相關基因信息占比最高,分別為26.23%、20.73%和7.58%。相較而言,古稻原產區(PMW)稻田土壤細菌類群表現出更強的碳(C)代謝潛力,包括甲醇氧化、發酵、纖維素分解(Cellulolysis)、甲烷營養、碳氫化合物降解和甲基營養代謝。同時,PMW 相較于其他研究區域還具有更低的N 和S 代謝潛力,包括反硝化作用、N2O 反硝化、亞硝酸鹽脫氮、硝酸鹽脫氮、亞硝酸鹽呼吸、硝酸鹽呼吸和氮呼吸,以及光合自養硫氧化和暗硫化物氧化作用。此外,PMW 稻田土壤細菌類群還表現出更低的延胡索酸呼吸和不產氧的光能自養能力。值得注意的是,關于人類疾病的微生物功能基因類群在PMW 也表現出極低的豐度,包括人類腸道炎癥、人類腹瀉、人類病原體肺炎和人類病原體。

圖4 不同研究區稻田土壤微生物菌群預測功能分組Fig.4 Functional prediction of the microbial flora in paddy soils of different regions

2.4 影響稻田土壤細菌群落的關鍵環境因素分析

Mantel 分析結果(圖5)表明,細菌群落主要是受空間距離(r=0.18)、pH (r=0.35)、CEC (r=0.39)、OM(r=0.14)、TN (r=0.24)、TP (r=0.14)、AK (r=0.18)、AP (r=0.14)和金屬Ni (r=0.21)的影響(P＜0.01)。功能潛力主要與空間距離(r=0.35)、pH (r=0.14)、TN(r=0.17)、TP (r=0.21)、AK (r=0.19)、AP (r=0.14)、Cd (r=0.19)、Cu (r=0.24)、Hg (r=0.21)、Ni (r=0.25)有極顯著相關性(P＜0.01)。此外,細菌Alpha 多樣性(Shannon指數)與空間距離(r=0.22)、TP (r=0.18)、AK (r=0.14)、AP (r=0.27)、Cd (r=0.23)、Cu (r=0.20)和Ni (r=0.27)呈極顯著相關性(P＜0.01);細菌豐度僅與OM (r=0.32)、TN (r=0.22)、TP (r=0.18)、AK (r=0.33)和Cu (r=-0.14)呈極顯著相關(P＜0.01)。

圖5 稻田土壤細菌群落結構、功能與土壤性質的關系Fig.5 Relationship between bacterial communities,function and soil properties of paddy soil

3 討論

3.1 稻田土壤基礎物化性質

本研究所涉及的稻田土壤均位于萬年縣縣城周邊,隸屬于珠溪河(樂安河一級支流)流域,周邊山丘環繞,形成了一個相對獨立的農田生態系統(圖1)。調查發現,該區域稻田土壤總體理化性質較為接近,包括pH、CEC、OM、TN、TP、AK、AP、Cr、Pb、Hg、Ni 和As 含量均未表現出明顯的空間分布差異(表1)。同時,本研究是在基肥施撒前進行的土壤樣品采集,受速效肥施撒的影響較小。古稻原產區(PMW)稻田土壤AN 和Cu 的含量較其他區域更為豐富。AN 被認為是影響水稻生長的關鍵性營養元素,而施撒有機肥有利于保持土壤肥力,減少土壤N流失[15],更適合擁有較長生長周期的古稻生長。古稻原產區(PMW)土壤被認為富含各種礦質元素[3],本研究進一步發現Cu 元素在古稻生長區的廣泛富集。Cu 同樣是植物必需的微量元素,但過量的Cu 會對大多數生物產生毒性作用[16],因此關注Cu 對古稻生長的影響是未來的一個研究方向。此外,研究還表明,Cd 作為我國南方稻田土壤的一種重要重金屬污染物[17],在珠田北(ZTN)和上坊西(SFW)地區含量較高,這可能與當地高背景值和礦物開采工作有關。施撒鋅肥(主要成分是ZnSO4)被認為是降低水稻吸收Cd 的重要農業措施[18],這可能是導致SFW 稻田土壤含有更高含量Zn 的原因。

3.2 古稻原產區稻田土壤細菌群落和功能特征

微生物作為地下土壤物質循環過程的主要參與者,其生物量和多樣性能夠表征生態系統的多功能性[19]。本研究發現,細菌豐度及Alpha 多樣性均未表現出明顯的空間分布差異(表2),這可能意味著整個研究區內細菌驅動的物質循環速率并未表現出巨大差異。然而,與其鄰近區域相比,古稻原產區(PMW)細菌群落組成表現出了一定的特異性,且組內空間異質性較低(圖2),表明古稻原產區微生態環境較為獨特。從細菌群落組成上來看,與鄰近區域相比,古稻原產區包含更高豐度的厚壁菌門和擬桿菌門,而酸桿菌門和硝化螺旋菌門的相對豐度偏低。有研究發現,厚壁菌門和擬桿菌門在植物體分解中發揮核心作用,其中厚壁菌門主要參與木質纖維素和半纖維素的降解,而擬桿菌門則是纖維素和木質素降解的關鍵微生物類群[20]。因此,古稻原產區包含豐富的厚壁菌門和擬桿菌門意味著該區域微生物具有較強的有機質分解能力。同時,隸屬于厚壁菌門的部分微生物類群還能夠與水稻形成穩定的共生關系,促進水稻的生長發育[21]。而酸桿菌門[22]和硝化螺旋菌門被認為在營養循環(N)中發揮著重要作用,這意味著古稻原產區鄰近區域可能也進行著較強的其他物化循環過程。此外,本研究還發現,一些屬于變形菌門(如Xanthobacteraceae_unclassified、Methylocystis)和放線菌門(Conexibacter)的屬也在古稻原產區大量富集。其中Methylocystis 被認為是參與甲烷代謝的關鍵類群[23],Conexibacter 可以利用林可霉素抗生素從而減少其對其他生物類群的抑制作用[24]。以上結果表明古稻原產區細菌群落結構的特異性主要體現在組成上,同時可能驅動著差異化的物質循環過程。

細菌群落的組成變化往往能夠反映到功能特征上。基于FAPROTAX 進行的功能預測分析發現,古稻原產區稻田土壤細菌群落具有較強的C 代謝遺傳潛力,例如有機質降解(發酵、纖維素分解等)和甲烷代謝等(圖4),這可能是受古稻原產區特殊的微地形和種植模式的雙重影響。有報道認為古稻生長在山垅之中,灌溉用的山泉中攜帶著大量的枯枝落葉及其分解物,為萬年貢谷的生長提供充足的有機營養物質[25]。同時,古稻具有較長的生長周期(160～175 d),有機肥作為一種緩釋肥能夠很好地保障稻谷生長需求,這種健康的水肥管理措施能夠激發微生物更加傾向于分解有機質為作物提供營養物質[26]。有研究發現,長期施用有機肥同樣可顯著提高土壤微生物量和酶活性,促進土壤有機碳和有機氮的協同利用,對提高土壤肥力具有重要作用[27-28]。而對于鄰近的其他研究區域,則表現出較強的N 和S 代謝潛力。有研究發現,長期施肥在增加土壤肥力的同時往往會改變稻田土壤微生物的群落組成,如增加酸桿菌門和硝化螺旋菌門的豐度[29],與本研究類似,而這些菌群往往是參與N 和S 循環的重要微生物類群。此外,施撒的無機肥多是一些速效營養元素,這些元素含量在施肥時瞬時放大,水稻難以及時有效利用,這些營養底物會誘導微生物的礦化[30]。在本研究中,附近區域的各種氮呼吸途徑(亞硝酸鹽脫氮、硝酸鹽脫氮、亞硝酸鹽呼吸、硝酸鹽呼吸和氮呼吸等)均會被增強。值得注意的是,古稻原產區稻田土壤中關于人類疾病的基因(如人類腸道炎癥、人類腹瀉、人類病原體肺炎和人類病原體)豐度較低,這進一步說明了該區域土壤更加健康,受人類污染影響較小。

3.3 驅動稻田土壤細菌群落變化的環境因子

細菌群落及其生物地理模式的研究可以深入了解其多樣性和生態系統功能的深層生態過程和機制[31]。近期的研究發現,生物群落在組成上的相似性受空間距離的影響存在不確定性[32]。同時,在較小尺度上關于人為干擾較嚴重的農田土壤的研究更為匱乏。本研究發現,細菌群落組成、功能和多樣性均受彼此空間距離的影響(圖2 和圖5),這除了當地受大生境的影響,還可能會受具體農田管理措施的影響。各樣點稻田隸屬于不同的耕作者,多處于不同的管理方式下,這在一定程度上也會影響細菌群落變化[33]。我們的研究表明,古稻原產區及其鄰近區域稻田土壤細菌群落組成除了受OM、TN、TP、AK和AP 等養分的影響,還受到pH 的重要影響。pH 被認為是影響我國稻田土壤微生物大尺度上空間分布的重要土壤因子[34]。本研究進一步表明,即使在小尺度上(地方河流水系),pH 依然是影響細菌群落組成的重要因素。此外,土壤調酸作為我國南方稻田土壤改良的一種重要手段,其帶來的生態環境變化未來還需要進一步的研究論證[35]。除了土壤pH 和各種養分,我們還發現重金屬(如Cd、Cu、Hg、Ni)元素也是影響細菌群落(組成、功能、多樣性或豐度)的重要土壤因子。一般認為,低濃度的重金屬可以促進作物的生長,而過量對任何生命體則是有害且致命的。近期的研究發現,重金屬含量的輕微變化都可能導致群落組成和微生物多樣性的劇烈變化[36]。因此,未來還需要進一步了解重金屬環境下的微生物的響應策略,探索特定功能微生物類群對重金屬的抗性及其與植物的互作關系。

4 結論

本研究探索了萬年古稻原產區土壤理化性質及細菌群落的特異性。結果表明,受當地地形、水系的影響,古稻原產區土壤僅AN 和Cu 較周邊區域含量更高。細菌群落組成(而不是豐度和多樣性)在古稻原產區表現出一定的特異性,相較于其他研究區域,表現出更高相對豐度的厚壁菌門和擬桿菌門,以及更低相對豐度的酸桿菌門和硝化螺旋菌門。此外,受古稻原產區長期健康水肥管理措施的影響,細菌群落表現出較強的C 代謝和較弱的N、S 代謝遺傳潛力。總體而言,本研究初步解析了萬年古稻原產區獨特的土壤環境特征。未來應逐步推廣施撒有機肥等緩釋肥,同時關注重金屬(如Cd、Cu、Hg、Ni)含量變化對當地土壤環境造成的潛在影響。