基于代謝組學探討阿司匹林對小鼠急性炎癥的干預作用

趙淑銳 王耀楠 吳英婷 鄭美青

（首都醫科大學藥學院，北京 100069）

0 引言

炎癥是機體對各種致炎因子的刺激所產生的病理過程[1]，具體表現為局部紅、腫、熱、痛和功能障礙等[2]。炎癥見于多種疾病的病理過程，發病前期多以急性炎癥為主，表現為以血管反應為中心的滲出性變化，久而不愈會漸漸轉為慢性炎癥。因此，開發安全有效的抗炎藥物具有巨大的臨床應用價值。

有研究表明，二甲苯雖然是低毒物質，但是其高濃度具有刺激作用。二甲苯、TPA、花生四烯酸等物質常被作為急性炎癥模型的致炎因子[3,4]。二甲苯引起的耳腫脹急性炎癥模型可能主要引起組胺、緩激肽等炎癥介質的釋放，引起局部血管擴張、毛細血管通透性增加、炎癥細胞浸潤，造成耳部急性滲出性炎癥水腫[5]。由于二甲苯誘導的小鼠急性耳腫脹模型可以作為典型的化學性因素引發的急性炎癥模型[6]，且易于操作、沒有特殊設備限制、建模時間短，成功率高等，因此常被用于抗炎藥物的篩選和評價藥理模型[7]。

阿司匹林（乙酰水楊酸），具有解熱、鎮痛、抗炎、抗風濕和抗血小板聚集等多方面的藥理作用。可以說阿司匹林在諸多疾病治療過程中起著不可或缺的作用。為了進一步闡明其在機體炎癥代謝過程中的影響，本實驗初步進行了阿司匹林在小鼠急性炎癥治療過程中的代謝組學研究。

實驗擬采用UPLC Q-TOF/MS 代謝組學技術，探討阿司匹林在二甲苯誘導的小鼠急性耳腫脹實驗中血漿代謝物的差異，分析其影響的相關代謝通路，明確其抗炎的作用機制，為相關抗炎新藥研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

體重20±2g (±SD g)的ICR雄性小鼠，購買于北京維通利華動物實驗技術有限公司。

1.2 試劑與儀器

色譜柱：Aquity UPLCTMBEH C18(2.1×50mm,1.7μm)，Waters；高速冷凍離心機：HITACHI himac CR22GⅡ；渦旋振蕩器：IKA MS3 digital；多功能樣品濃縮儀：北京普利泰科儀器有限公司，EVA30A；超高效液相色譜: Acquityi-class，waters公司;四級桿飛行時間質譜聯用儀: Synapt G2-Si，waters公司;超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司，KQ-500E型；甲醇(Fisher，LC/MS)；乙腈(Fisher，LC/MS)；超純水，甲酸(Fisher, LC/MS)。

圖1 基于UPLC-MS數據所得PCA得分圖

圖2 基于UPLC-MS數據所得PLS-DA得分圖

1.3 試驗方法

30只體重20±2g (x±SDg) 的小鼠，在靜息飼養一天后均衡隨機分為3組，分別為實驗組（阿司匹林Asp組，灌胃給藥20mg/kg），模型組（model組，生理鹽水），正常對照組（shame組，不做任何處理正常飼養）。采用序灌法分別對給藥組和對照組小鼠給藥，給藥30min后按照給藥順序依次在小鼠的右耳外廓均勻涂抹30μL二甲苯溶液，進行耳腫脹造模。小鼠右耳外廓涂完二甲苯后變紅，并逐漸發白變厚。造模2h后，按照給藥順序依次摘眼球取血處死小鼠，將小鼠左右耳分別貼耳根剪下，小心重合疊放，選用型號為YLS025A電動耳腫打耳器(圓孔直徑7mm)在兩耳的相同位置打孔，將得到的圓形耳片分別稱重，記錄[8]。依據如下公式計算腫脹度：

腫脹度(mg)=右耳圓片重量-左耳圓片重量

實驗數據統計采用t檢驗進行分析，以x±SDmg表示。

1.4 血漿樣品提取

實驗結束后小鼠摘眼球取血，所有血液樣本均收集在肝素化EP管中。樣品采集后于4℃，3000轉/分鐘離心10分鐘，取上清液100μL于1.5mL離心管內，加入300μL甲醇渦旋30秒，將所有樣品在4℃下15000rpm離心，持續15分鐘。每樣品取上清300μL，轉移到1.5 mL離心管中，低溫下經氮氣吹干。吹干后，用100μL甲醇復溶樣品，4℃下15000轉/分鐘離心，持續15分鐘。取上清液轉移至進樣小瓶。每個樣品取10μL混合在一起作為質量控制(QC)。

1.5 UPLC/MS分析方法

色譜分離使用Acquity UPLCTMBEH C18色譜柱(2.1mm×100mm，1.7μm，美國Waters公司)。流動相A為0.1%的甲酸水溶液，流動相B為0.1%的甲酸乙腈，采用梯度洗脫(見表1)，柱溫35℃，流速為350μL/min，進樣量為2μL。質譜采用電噴霧離子源，正、負離子模式進行檢測。儀器參數：毛細管電壓1000V，去溶劑氣流速800L/h，溫度450℃，源溫度120℃，錐孔氣流速50L/h，噴霧氣壓6bar，碎裂電壓20～45V，取樣錐孔電壓6V，采集模式為MSEcontinuum，分辨率模式，帶電粒子的質量數與電荷數之比(m/z)數據采集范圍100～1000，低能量通道碎裂電壓6V，高能量通道碎裂電壓選擇梯度電壓20～60V。

表1 液相梯度洗脫條件

2 結果與討論

2.1 阿司匹林對二甲苯誘導的小鼠急性耳腫脹影響

由實驗結果可以看出（見表2），生理鹽水空白對照組的耳腫脹度為13.41±2.38mg，阿司匹林通過灌胃給藥方式，在200mg/kg劑量下耳腫脹度為7.61±1.22mg；結果經t檢驗，阿司匹林組與生理鹽水組相比，P＜ 0.01二者之間統計學上存在顯著性差異。

表2 各組耳腫脹度結果

基于UPLC-MS所得到的質譜數據。運用QI軟件對數據進行歸一化以及峰對齊結處理。通過對正常對照組，模型組組，和實驗組數據進行無監督的PCA分析。結果發現正負兩種離子模式下的數據PCA評分圖(見圖1)顯示正常對照組（shame）和模型組(model)和實驗組(Asp)之間的分離是明顯的，表明3組具有完全不同的代謝組成。為了評估二甲苯誘導的急性炎癥小鼠代謝組學的系統變化，基于正常對照組（shame）、模型組(model)、實驗組(Asp)建立PLS-DA模型。在PLS-DA數據分析的得分圖中可以更加明顯的觀察到3組的分離趨勢(見圖2)。

設定變量投影重要度參數VIP(Variable important for the projection)，VIP 值越大，差異越顯著。PLS-DA分析選定VIP 值≥1。以這種方式，在ESI正離子模式中鑒定了576種化合物物，并且在ESI負離子模式中鑒定了512種化合物。通過化學搜素引擎（chemspider）對這些選擇的化合物的精確質量和質量碎片的數據進行數據庫(KEGG，HMDB，Nature Chemistry，Nature Chemical Biology)搜索。結果，最終保留了9種推定的代謝物用于進一步代謝組學分析。9個相對標準偏差P＜0.01的代謝物與其他細節一起列于表3中。

表3 潛在代謝物差異標志物

基于鑒定的具有顯著性差異的代謝物標志物，將鑒定的9種生物標志物輸入到MetPA (http:// metpa.metabolomics.ca./MetPA) 數據庫中，構建代謝通路，使用代謝組學分析軟件（MetaboAnalyst）對阿司匹林調節的代謝途徑和網絡進行更詳細的分析(見圖3)。

圖3 阿司匹林主要影響的代謝通路

2.2 討論

選定潛在的目標代謝物通路分析impact-value≥0.10，揭示了標記的代謝產物對于阿司匹林干預二甲苯導致的小鼠急性炎癥的代謝的重要性。由分析結果看阿司匹林干預二甲苯導致的小鼠急性炎癥中主要影響了4條代謝途徑，包括抗壞血酸和醛酸代謝，甘油磷脂代謝，葡萄糖醛酸酯的相互轉化代謝，花生四烯酸代謝。

文獻報道[9]炎癥可以引起磷脂代謝的紊亂，脂質是細胞膜的結構成份，其具有激活和參與信號轉導途徑、維持電化學梯度和轉運蛋白等生物功能[10,11], 其代謝紊亂也會導致炎癥的發生[12]。甘油磷脂也是花生四烯酸的前體物質，花生四烯酸代謝是炎癥代謝網絡的核心。機體炎癥刺激后釋放花生四烯酸，然后被氧化并進一步修飾以形成各種類二十烷酸，包括前列腺素，血栓素和白細胞三烯[13]。生理鹽水組中的花生四烯酸代謝物5-HPETE水平與正常對照組相比有所升高，阿司匹林治療干預后，5-HPETE水平有所下調。從實驗結果可以推測阿司匹林存在潛在調節甘油磷脂代謝的功能。

在抗壞血酸代謝和葡萄糖醛酸酯相互轉化的過程中，D-葡萄糖醛酸在一系列酶的作用下可轉化為抗壞血酸。抗壞血酸作為強效的水溶性抗氧化劑，其可以抑制白細胞中的過氧化物酶/過氧化氫/鹵化物系統的活化，進一步影響白細胞的運動[11]。實驗結果發現生理鹽水組中的D-葡萄糖醛酸水平明顯高于正常對照組，表明機體受到刺激釋放更多的抗壞血酸以抑制炎癥反應。文獻報道[14]酵母誘導的發熱模型中炎癥反應強烈，并發現D-葡萄糖醛酸水平升高。阿司匹林干預后，D-葡萄糖醛酸水平下降，表明阿司匹林可能逆轉了D-葡萄糖醛酸水平。

3 結語

本實驗通過采用代謝組學的研究方法，考察阿司匹林在二甲苯導致的ICR小鼠的耳腫脹模型中影響的代謝途徑。阿司匹林逆轉了9種急性炎癥的血漿代謝物標志物。抗炎活性主要通過調節血漿中的抗壞血酸和醛酸代謝，甘油磷脂代謝，葡萄糖醛酸酯的相互轉化代謝，花生四烯酸代謝。這一結果為以后相關抗炎新藥作機制研究提供一定的思路及依據。