血栓通對阿爾茨海默癥模型小鼠認知功能及神經異常興奮性的作用及其機制研究

劉 慧 ，嚴國紀 ，吳 嘉 ，王 丹 ，習楊彥彬 ，李珊珊

（1）昆明醫科大學神經科學研究院;2）基礎醫學院實驗教學中心，云南 昆明 650500）

阿爾茨海默?。╝lzheimer’ s disease，AD）是最典型的癡呆癥形式，預計老年人的發病率將進一步呈指數級增長，導致全球近4 700 萬人患病[1]。AD 的特征是認知能力的逐漸下降，這將會對患者的家庭和衛生保健系統造成沉重的負擔。研究人員一直在試圖尋找可能有助于減緩AD 進展的藥物治療方法。然而到目前為止的結果并不令人滿意[1]。因此，開發治療AD 的新藥成為當務之急。

血栓通是一種臨床上常用于預防和治療缺血性疾病的中藥制劑，其有效成分主要為三七皂苷[2]。研究表明，血栓通能夠在抗心肌梗死、抗血栓形成、抗腦缺血/再灌注損傷、抗氧化和改善微循環障礙等方面發揮作用[3-7]。作為血栓通的主要成分，三七皂苷在多種疾病中的治療作用也被廣泛報道[8-12]。研究表明，血栓通在AD 動物模型中具有神經保護作用[13]。血栓通在AD 早期通過提高超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶的活性來對抗氧化應激損傷[14]，也可通過調控α 和β 2 種分泌酶來減少Aβ1-42和Aβ1-40沉積從而減少淀粉前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）產生[15]。然而在AD 小鼠模型中血栓通是否通過調節神經元興奮性發揮神經元保護作用尚不清楚。

在本課題組之前的研究中證實，Navβ2 的編碼基因SCN2B 可能與快速老化小鼠額葉和海馬的老化進程密切相關[16]；SCN2B 下調60.68%通過增加海馬神經元棘突的數量，顯著改善轉基因小鼠海馬依賴性的空間認知記憶并且有利于易化海馬神經元的長時程電勢[16]；在AD 動物海馬中Navβ2 增齡性表達上調的同時還存在顯著的功能異常，表現為Navβ2 過度降解（由BACE1 及γ-secretase）及促使鈉離子通道蛋白功能亞基Nav1.1α發生異常的細胞內轉位，Navβ2 knockdown 部分糾正了APP/PS1 轉基因鼠海馬和額葉皮質中Navβ2 的異常狀態，扭轉了Navβ2 的過度降解及異常的Nav1.1α 細胞內轉位，部分恢復了APP/PS1轉基因鼠海馬神經元的電興奮性，并顯著改善轉基因小鼠學習記憶能力，促使APP 向非淀粉樣酶解途徑進展[17-18]。這些研究結果確定了SCN2B 在腦老化認知功能障礙發生中的作用；而血栓通用藥后可以顯著逆轉SCN2B 在快速老化小鼠大腦組織中的增齡性表達上調[16]。綜上所述，結合文獻報道及前期研究工作，筆者推測血栓通的抗腦老化作用可能與對學習記憶功能腦區Navβ2 的表達調控相關，本文圍繞此論點展開研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物2 月齡的C57BL/6J 小鼠（野生型，WT 小鼠）購自昆明醫科大學實驗動物中心，APP/PS1 轉基因小鼠購自美國杰克遜實驗室。小鼠均分籠飼養與21 ℃～25 ℃的轉基因動物房內，相對濕度50%～60%，光照時間為12 h/ 12 h 晝夜交替，飼料與飲水正常供給。本研究通過昆明醫科大學倫理委員會批準進行實驗動物護理和相關操作，倫理批號：Kmmu20190024。手術過程中采用異氟烷誘導麻醉。

1.1.2 藥品來源血栓通為云南植物藥業有限公司生產的注射液，主要成分為PNS，總苷含量 >70%（Rb1 >30%，Rg1 >20%，R1 >5%），批號：Z53020135，規格：100 mg/2 mL 每支。

1.2 動物分組

APP/PS1 轉基因小鼠被隨機分成兩組，每組15 只，藥物治療組用滅菌醫用0.9% 氯化鈉按5 mg/mL 配制，以60 mg/kg 對血栓通組（APP/PS1+PNS）行灌胃，每日1 次，連續6 個月給藥。對照組小鼠予同等體積的0.9% 氯化鈉（APP/PS1+Vehicle）灌胃處理，同月齡野生型小鼠予0.9%氯化鈉灌胃處理作為正常對照組（WT+Vehicle）。

1.3 新物體識別實驗

連續給藥6 個月后，進行新物體識別實驗（硬件及分析軟件均購自上海欣軟信息科技有限公司），評估小鼠對新物體任務的記憶。使用一個40 cm×40 cm×40 cm 的透明塑料盒作為實驗儀器，全程攝像頭記錄。實驗持續3 d。實驗第1 天為小鼠適應階段，將小鼠放入儀器進行實驗前的環境適應，時間為5 min，在此時間內小鼠可以自由的探索實驗環境，此時環境不放置任何物體。第2 天，在儀器內放置兩個完全相同的物體，將小鼠從同一位置放入儀器，進行5 min 的探索。第3 天，一個新物體作為儀器中一個物體的替代品，再將小鼠從相同位置放入儀器，進行5 min的探索，并記錄小鼠探索新物體和原有舊物體所花費的時間。計算每只小鼠的物體辨別指數（discrimination index，DI）。DI=（探索新奇物體的時間-探索熟悉物體的時間）/（探索新奇物體的時間+探索熟悉物體的時間）×100%。

1.4 Morris 水迷宮實驗

Morris 水迷宮由1 個圓形池（直徑100 cm，深50 cm）組成，里面充滿了（24±1）℃以及20 cm深的白水。Morris 水迷宮按文獻描述進行[16]。所有的小鼠都進行1 個初步的預實驗，讓它們能夠適應水，并讓它們踩上1 個白色的平臺（隱藏在水面下），這樣可排除小鼠因游泳能力不足或視力障礙而不能找到平臺干擾實驗結果。預實驗是在常規測試的前1 天進行。在這個實驗中，小鼠被放置在水中游60 s，然后被放置在1 個淹沒在水下的白色平臺上停留1～2 s。預實驗結束后是為期5 d 的學習訓練，隱藏的平臺被放置在1 個不同的位置。小鼠從入水至發現隱藏的水下白色平臺所需的時間被記錄為逃逸潛伏期，并連續記錄5 d。在訓練第6 天的探針實驗中，平臺被移除，在60 s，記錄小鼠在目標象限中花費的時間百分比、在目標象限中游泳路徑和通過目標平臺的次數，以及在這四個象限內所花費的時間和游泳的總距離，以評估它們對平臺位置的記憶。用頭頂攝像機跟蹤動物，數據用動物行為視頻分析系統進行分析（上海欣軟信息科技有限公司）。

1.5 腦電圖檢測

對于腦電圖（electroencephalogram，EEG）記錄，研究中使用了使用聚酰亞胺微電極陣列（PBM 陣列）的高分辨率小鼠腦電圖。根據文獻進行電極植入、腦電圖記錄、數據采集和分析方法操作[17，19-20]，并進行了一些改良。麻醉電極麻醉后將小鼠固定在立體定向儀器上，然后記錄腦電圖。首先，切開頭皮中部2 cm 暴露顱骨，確定顱骨和顱點。根據小鼠腦圖譜，這些點是小鼠大腦表面可識別的電極位置。在小鼠腦立體定位儀的指引下將電極植入海馬（AP-2.1 mm，ML-1.5 mm，DV-1.5 mm），其中植入1 個裸露尖端的三導線電極（直徑1.0 mm），由3 根裸露尖端的聚酰亞胺涂層的導線組成，用于接地和參考的微螺釘分別固定在小腦上方的枕骨上。植入微電極的小鼠予術后5～7 d 的時間恢復。記錄當天，信號采集在小鼠的籠子中進行，從上午10 時至11 時采集自由移動小鼠的腦電圖信號。將連接器連接到一個多通道的腦電圖放大器系統，并收集神經電信號。由記錄電極收集到的原始記錄信號被放大器放大1 000倍。模擬信號由CEDMicro1401 數據采集系統以1 kHz 的采樣頻率進行數字化，記錄每30 s 生成一次功率譜密度（power spectral densities，PSDs），以計算在>6 Hz（高頻）的持續時長（高頻時間）。信號處理確保整數值代表每30 s 內Hz 的主導頻率（dominant frequency，DF）。以30 s 為1 個記錄周期，每只小鼠每30 s 計算1 次，收集計算每只小鼠在總記錄時間（1 h）的平均DF。高頻時間的計算方法是用DF >6 Hz 將30 s 總周期相加，然后除以每個小鼠記錄的總時間[17，20]。

1.6 Western blot

腦電圖記錄（1 周后），小鼠頸椎脫位。取出大腦，浸泡在冷磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中。一半的大腦用于免疫印跡，其余的用于細胞表面生物素化檢測。對于Western blot 分析，腦組織分別使用預冷的裂解緩沖液（碧云天生物技術公司）在冰上勻漿。勻漿液在4 ℃下以r/min。使用BCA試劑（Sigma-Aldrich;Merck KGaA，Darmstadt，Germany）方法定量蛋白質。在4%～12%的凝膠上，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量的蛋白質并轉移到硝化纖維素膜上，將硝化纖維素膜轉移到封閉液中，室溫封閉1 h，封閉后將膜放入1×TBST 中清洗10 min。隨后，與抗BACE1（1:1 000;Cat.No.ab2077;Abcam），Nav1.1α（1:800;Cat.No.ASC-001;Alomone），或Navβ2（1:500;Cat.No.ASC-007;Alomone）一抗進行孵育。GAPDH（1:800;Cat.No.Sc-365 062;Santa Cruz，Delaware，CA，USA）作為內參對照。隨后將膜與適當的二抗在20～25 ℃下孵育2 h。用辣根過氧化物酶偶聯的抗兔抗體檢測Nav1.1α 和Navβ2（1:2000;Cat.No.PI-1 000;Vector Laboratories，Inc ），GAPDH 檢測采用過氧化物酶偶聯的抗小鼠二抗（1∶1 000;Cat.No.PI-2000;Vector Laboratories，Inc）。采用增強化學發光發光試劑（碧生物技術研究所，上海，中國）進行蛋白質定量。使用Bio-Rad 凝膠成像系統（ChemiDoc? XRS+;Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA）及分析軟件v4.6.6（Bio-Rad 實驗室公司）對目標蛋白帶進行密度分析，以量化蛋白表達水平。

1.7 細胞表面生物素化實驗

將剩余的腦組織放入冰冷的Krebs 溶液中，該溶液中含有先前描述的[20]修飾成分（計量單位為mmol/L）：120 氯化鈉、4.5 氯化鉀、1.5 磷酸氫二鉀、10 葡萄糖、1.5 硫酸鎂、26 碳酸氫鈉和1.5 氯化鈣。細胞表面生物素化和細胞表面Nav1.1α 的檢測步驟按文獻報道進行[17，20]。使用中微子親和素瓊脂糖珠（美國皮爾斯）拉下生物素化蛋白質，將生物素化的細胞表面蛋白與瓊脂糖珠結合，用于進行細胞外表達分析。其余含有非生物素化蛋白的裂解液用于檢測Nav1.1α 的細胞內蛋白。用SDS-PAGE 樣品緩沖液在37 ℃下孵育60 min 進行洗脫，并通過SDS-PAGE 分析，然后進行如上所述的Western blot 檢測。

1.8 統計學處理

使用SPSS19.0 Windows 軟件包進行統計分析。數據以均數±標準差（）表示。2 組間的比較采用Student’s t檢驗。采用方差分析（ANOVA）和Bonferroni事后檢驗來評估多組間的統計學差異。Morris 水迷宮分析采用雙向重復測量（RM）方差分析，然后采用Tukey檢驗。新物體識別實驗數據采用雙向方差分析進行分析。腦電圖數據采用單因素方差分析，然后對配對組（Two tailed，雙尾組）進行t檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血栓通對APP/PS1 小鼠認知功能障礙的影響

采用Morris 水迷宮實驗和新物體識別實驗，評價血栓通對APP/PS1 小鼠學習記憶功能的影響。雙向重復測量方差結果顯示，WT+Vehicle、APP/PS1+Vehicle 和APP/PS1+PNS 組中小鼠的逃逸潛伏期隨著時間的推移而逐漸縮短。2 月齡小鼠逃逸潛伏期各組之間差異無統計學意義（P>0.05）。然而，與年齡匹配的WT 小鼠相比，8 月齡APP/PS1 小鼠花了更多的時間來尋找隱藏的平臺，差異有統計學意義（P<0.05），見圖1A。在去除平臺后的探針實驗中，各組2 月齡小鼠在目標平臺穿梭次數、目標象限花費的時間和目標象限的路徑百分比方面差異無統計學意義（P>0.05），見圖1B，圖1C，圖1D。與同月齡WT 小鼠相比，8 月齡APP/PS1 小鼠在目標象限的時間縮短，目標平臺穿梭的次數減少，在目標象限的路徑百分比降低。血栓通處理部分改善了APP/PS1 小鼠的空間學習記憶能力（P<0.05），見圖1B，圖1C，圖1D。

圖1 Morris 水迷宮任務顯示血栓通對APP/PS1 小鼠空間學習記憶變化的影響Fig.1 Morris water maze task shows the effect of xueshuantong on spatial learning and memory changes in APP/PS1 mice

從新物體識別實驗中獲得的DI 顯示，2 月齡的WT 和APP/PS1 小鼠在探索新物體方面無顯著差異（P>0.05），見圖2B。與年齡匹配的WT 小鼠相比，8 月齡APP/PS1 小鼠在探索新物體上花費的時間更少（P<0.05），見圖2B。血栓通治療增加了APP/PS1 組探索新對象的時間（APP/PS1+PNSvs.APP/PS1+Vehicle，P<0.05），見圖2A，2B。綜上所述，血栓通是一種改善AD 轉基因小鼠空間學習和記憶喪失的有益藥物，見圖1，圖2。

圖2 血栓通對APP/PS1 小鼠新物體識別任務的影響Fig.2 Effect of xueshuantong on novel object recognition task in APP/PS1 mice

2.2 血栓通對APP/PS1 小鼠神經元興奮性的影響

為了研究血栓通對APP/PS1 小鼠異常神經元高興奮性的影響，本研究對不同處理的WT 小鼠和APP/PS1 小鼠進行了腦電圖記錄。根據EEG 記錄結果顯示，與相同月齡的WT 小鼠比較，8 月齡APP/PS1 小鼠神經活動出現明顯異常，棘波放電（spike-wave discharges，SWDs）增加，見圖3。然而，用血栓通處理的8 月齡APP/PS1 小鼠表現出下降的神經元興奮性，但沒有達到年齡匹配的WT 小鼠的水平，見圖3。

這些結果表明，血栓通處理改善了APP/PS1突變誘導的神經元高興奮性。

2.3 血栓通對APP/PS1 小鼠體內BACE1 和Nav表達水平的影響

本研究探討了血栓通改善認知功能、下調神經元興奮性的機制。本研究評估了神經元電興奮性的維護者Nav 蛋白家族成員和BACE1 在各組小鼠額葉皮質及海馬區的表達情況。結果發現，血栓通處理顯著降低了APP/PS1 小鼠皮質和海馬中BACE1 的表達（APP/PS1+PNSvs.APP/PS1+Vehicle，P<0.05），見圖4A-4B。同時，在血栓通處理的APP/PS1 小鼠中檢測到Navβ2 全長片段增加，Navβ2-CTF 片段減少（APP/PS1+PNSvs.APP/PS1+Vehicle，P<0.05），見圖4C-4D。這些結果還表明，血栓通對皮質或海馬中Nav1.1α的細胞外和細胞內異常分布進行了糾正（APP/PS1+PNSvs.APP/PS1+Vehicle，P<0.05），見圖4E-4H。

圖4 血栓通改變APP/PS1 小鼠中Nav1.1α 的分布和Navβ2 的裂解Fig.4 Xueshuantong alters Nav1.1α distribution and Navβ2 cleavage in APP/PS1 mice

綜上所述，血栓通誘導的神經元興奮性的減輕可能與Navβ2 切割的減少有關，從而部分逆轉了Nav1.1α 在皮質或海馬中的異常分布。

3 討論

本研究結果顯示血栓通（主要有效成分三七皂苷）給藥后顯著改善了APP/PS1 小鼠學習、空間記憶功能并減輕了神經元的異常高興奮性。結合前人的研究報道：APP/PS1 小鼠皮質裂解液中BACE1 表達水平、Navβ2 降解片段（Navβ2-CTF）以及Nav1.1α 的表達和分布發生異常[20]，作者推測：血栓通改善AD 小鼠的認知功能和神經元高興奮性可能與對Nav 通道的表達調控有關。

臨床上以顱內/腦出血為特點[21]的常見腦損傷，通常發展為認知缺陷的癥狀[22]。而前人的研究表明，通過結合抗炎、抗血栓和抗凋亡特性，PNS 在治療伴有認知障礙的神經系統疾病中具有顯著優勢[7-8，23]。已有研究報道，使用血栓通可減少急性腦出血患者的炎癥反應，增加血腫吸收，并改善行為功能[12]。在本研究中，作者發現血栓通可能有助于改善認知功能缺陷和恢復AD 誘導的神經元損傷。通過研究，作者發現，血栓通改善了APP/PS1 突變引發的學習記憶障礙并降低了神經元的過度興奮性。

Nav 家族蛋白在神經元動作電位的發放、正常電興奮性的維持中起到了主導作用，其家族成員的表達異常、活性改變勢必會誘導神經元電興奮性發生異常，引發一系列的病理改變。在先前的研究中，作者發現，與4 月齡（正常）快速老化小鼠相比，SCN2B（Navβ2 的編碼基因）在8、12月齡加速老化的小鼠皮質額葉中表達上調，血栓通用藥后顯著下調了8、12 月齡快速老化小鼠腦內衰老相關基因SCN2B（Navβ2 的編碼基因）的水平，誘導了學習記憶行為的改善[16]，此結果提示Navβ2 在小鼠腦老化進程中發揮了重要作用，而血栓通有可能通過對Navβ2 的靶向調控發揮神經保護作用。另有研究表明，Nav1.1α 水平的升高與小鼠的認知缺陷有關[20]；而Navβ2 knockdown可以扭轉Navβ2 的過度降解及異常的Nav1.1α細胞內轉位，部分恢復APP/PS1 轉基因鼠海馬神經元的電興奮性并顯著改善APP/PS1 小鼠的學習記憶能力[17-18]。在本研究中，發現血栓通抑制了APP/PS1 小鼠腦內BACE1 的活性，從而減少了Navβ2 的過度降解，糾正了Nav1.1α 的異常表達與分布。此結果提示，血栓通在APP/PS1 小鼠模型中發揮的神經保護作用與Nav 蛋白調控的神經元高興奮性的恢復有關，即血栓通通過調節鈉通道的表達，從而糾正了AD 小鼠的異常神經元興奮性并改善了AD 小鼠的認知功能損傷。

有趣的是，本研究還發現了血栓通用藥后顯著抑制了淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）代謝關鍵酶BACE1 的活性。鑒于BACE1 抑制可以有效減少APP 毒性代謝產物Aβ 的產生，近年來，BACE1 酶抑制劑的使用為AD 提供了有價值的治療策略[24-26]。而有研究證實，Navβ2 作為BACE1 的新發現底物，具有與APP 類似的代謝途徑，可能參與到了AD 的致病過程[27]。本研究結果發現，血栓通處理顯著抑制了BACE1 的活性、減少了Navβ2 的裂解，也糾正了Nav1.1α的異常分布，部分恢復了神經元異常的興奮性。此結果提示血栓通可能有希望成為治療AD 的藥物之一，其作用機制可能通過抑制BACE1 介導的Navβ2 異常酶解、維持Nav 通道的穩定性，從而恢復了神經元的正常電興奮性。

綜上所述，本研究結果表明，血栓通改善了神經元異常過度興奮，顯著促進了AD 小鼠的神經元修復和改善記憶功能，此作用與Nav 蛋白的調節有關。