Eupatilin通過Sesn2-Nrf2保護線粒體功能在膿毒癥腦損傷中的作用

王加棟 黃方舟 黃艷 陳管雄 劉軍 黃佩琦

長沙市第四醫院 （湖南師范大學附屬長沙醫院）急診急救中心 （長沙 410006）

膿毒癥相關腦病（sepsis-associated Encephalopathy ，SAE）作為ICU中最常見的一類腦病，定義為各種感染體因彌漫性腦功能障礙引起的炎癥反應［1］。臨床數據顯示，SAE可影響15% ～ 70%的患者，導致嚴重的認知功能障礙［2-3］。在實驗性SAE中，盲腸結扎和穿孔（cecal ligation and puncture ，CLP）手術誘導的活性氧和炎癥介質的過量產生可通過血液傳播并穿過血腦屏障，最終導致大腦皮層和海馬損傷傷［4-5］。目前對SAE的潛在機制仍知之甚少，其在認知功能方面的影響仍是值得關注的臨床問題。Sestrin2（Sesn2）是Sestrin家族的成員，是一種重要的應激誘導蛋白，在各種應激下被誘導，包括缺血、缺氧、高糖、DNA損傷、氧化應激和內質網應激［6］。據報道，Sesn2正調節核因子紅系-2相關因子2（Nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2）的激活［7］。Nrf2被認為是內源性抗氧化防御和線粒體生物發生的主要調節因子。研究表明，Nrf2激活劑減輕SAE大鼠模型的神經炎癥和氧化應激并改善認知障礙［8］。此外，Sesn2的升高減少了活性氧的積累，而Sesn2的基因缺失則加劇了線粒體功能障礙［9］。Sesn2過度表達在緩解CLP誘導的SAE中的確切作用和機制仍然未知。本研究通過CLP誘 導的SAE小鼠模型確定Sesn2激動劑Eupatilin是否通過激活Sesn2-Nrf2通路改善線粒體損傷并保護SAE相關認知功能障礙，旨在加深我們對SAE中線粒體功能的認識，并為進一步 研究提供了有價值的候選靶標。

1 材料與方法

1.1 動物和分組處理120只6周大的雄性C57BL/6J小鼠購自重慶恩斯維爾生物科技有限公司（動物生產許可證：SCXK（渝）2019-0004S），并飼養在特定的無病原體環境中，光照/黑暗周期為12 h，光、溫度和濕度可控，食物和水可隨意獲得。按照計算機隨機分組方法將小鼠隨機分為3組，每組40只：假手術（Sham）組、CLP組、CLP + Eupatilin組。參照文獻方法，建立由CLP誘導膿毒癥模型，該模型可導致急性多菌性腹膜炎［10］。用1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg，美國Sigma公司）麻醉小鼠，將腹腔切開1 cm。暴露盲腸并在回盲部下方結扎。用22號針頭兩次穿刺誘導輕度膿毒癥。假手術動物進行相同的開放手術，但沒有CLP。CLP + Eupatilin組小鼠經尾靜脈注射10 mg/kg Eupatilin（德國Phoenix Pharmaceuticals公司），每天1次，連續3 d，給藥劑量參照文獻方法［11］。動物實驗方案經本院倫理委員會審批同意（審批號：倫審2021-07）。

1.2 神經行為測試通過修改的神經病學嚴重程度評分（mNSS）來確定小鼠神經行為。mNSS是對運動、感覺、反射和平衡的綜合測試。不能完成任務或反射能力不足的小鼠得1分。累積分數在13 ～ 18之間表示嚴重受傷；7 ～ 12表示中度傷害；1 ～ 6表示輕傷［12］。

1.3 莫里斯水迷宮試驗Morris水迷宮（Morris Water Maze，MWM）用于評估空間學習和記憶功能［13］。具體操作為，訓練小鼠在不透明的水中尋找一個隱藏的平臺，為期5 d，每天從偽隨機位置開始進行4次獲取實驗。逃避潛伏期，即找到隱藏平臺的時間，是空間學習和記憶的指標。在訓練試驗的第6天，進行探尋試驗（拆除水下平臺），讓小鼠在水池中搜索1 min。在目標區域的時間和探測軌道上平臺之間的時間被用作參考記憶的指標。在訓練過程中，使用MicroPublisher自動跟蹤系統（西班牙Panab公司）獲取并分析行為數據。

1.4 尼氏染色法MWM測試結束后，處死小鼠，將分離的腦切片用10%福爾馬林固定24 h，用乙醇脫水，石蠟包埋，在載玻片上切成5 μm厚的切片。組織切片用0.5%乙酸甲酚紫染色，用DFC420光學顯微鏡（德國Leica公司）觀察，以計數海馬CA1區的神經元數目。

1.5 透射電子顯微鏡將1 mm3的海馬切片在1%四氧化鋨中固定1 h，然后在2%乙酸鈾酰中染色，并在4 ℃下包埋在100%丙酮中過夜，切成100 nm的切片。由HT-7500透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司）捕獲圖像。

1.6 蛋白質印跡分析使用RIPA裂解緩沖液（上海Beyotime公司）從海馬、皮質組織或HT22細胞中提取粗蛋白質。采用雙辛可寧酸試劑測定蛋白質濃度。取20 μg樣品進行SDS-PAGE電泳，然后轉移到PVDF膜（美國GE Healthcare公司）上。用5%脫脂奶粉封閉膜1 h，并與針對GPX4（1∶1 000，英國Abcam公司）、ACSL4（1∶500，美國abclonal公司）、Sestrin2（1∶500，英國Abcam公司）、Nrf2（1∶1 000，美國Protentech公司）、GAPDH（1∶1 000，美國Santa Cruz公司）一抗在4 ℃孵育過夜。然后將膜與HRP偶聯的二抗（1∶5 000，英國Abcam公司）一起溫育1 h，并在用PBS洗滌后用ECL化學發光系統（美國Thermo Fisher公司）觀察條帶。使用Image J軟件來量化信號。

1.7 免疫熒光處死小鼠，將腦組織剝離進行蔗糖梯度脫水，最后用低溫恒溫器切成5 μm切片。將切片與Sestrin2（1∶200，英國Abcam公司）、Nrf2（1∶200，美國Protentech公司）、Iba1（1∶200，美國R&D公司）和CD68（1∶200，美國Santa Cruz公司）第一抗體稀釋在封閉緩沖液中，然后在4 ℃下與適當的熒光綴合的第二抗體（1∶200，美國Jackson Immuno-Research公司）一起孵育2 h。最后，對切片進行DAPI染色（1∶5 000，北京Solarbio公司）以觀察細胞核，并使用熒光顯微鏡（德國Zeiss公司）成像。

1.8 細胞培養小鼠海馬神經元細胞系（HT22細胞）購自美國典型培養物保藏中心（ATCC），在補充100 U/mL青霉素/鏈霉素和10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養基（美國Gibco公司）中培養。為了探討Sesn2-Nrf2通路在抗線粒體損傷中的作用，將HT22細胞隨機分為對照組（Con）、脂多糖組（LPS）、脂多糖+Eupatilin處理組（LPS+Eupatilin）、脂多糖+Eupatilin+Nrf2 siRNA處理組（LPS+Eupatilin+si-Nrf2）。對照siRNA（si-con）或NRF 2 siRNA（si-NRF 2；均購自上海GenePharma有限公司）在LPS刺激前用Lipofectamine 2000TM試劑（美國Invitrogen公司）轉染HT-22細胞48 h。將LPS（1 μg/mL，美國sigma Aldrich公司）加入細胞培養基中24 h。在LPS+Eupatilin組和LPS+Eupatilin+ si-Nrf2組中，在LPS刺激前1 h，將細胞與Eupatilin（50 μmol/L）一起孵育［14］。

1.9 末端脫氧核苷酸轉移酶介導的缺口末端標記（terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL）染色用PBS洗滌細胞3次，并用4%多聚甲醛固定細胞，和用0.5%Triton X-100處理。然后將細胞與50 μL TUNEL反應混合物（瑞士Roche公司）在37 ℃孵育1 h，用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）進行核染色。在熒光顯微鏡下觀察TUNEL陽性細胞。

1.10 線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）根據線粒體膜電位檢測試劑盒（美國Sigma公司）的使用方法，使用JC-1作為熒光探針快速檢測HT22細胞中的MMP。通過熒光顯微鏡捕獲熒光，并使用Image-Pro Plus 6.0軟件進行數字化。

1.11 統計學方法分別采用GraphPad Prism 8和SPSS 21.0軟件作圖和分析數據。所有定量數據均表示為平均值±標準差。通過單向方差分析評估差異（ANOVA三組或更多組）。當只比較兩組時，使用不成對t檢驗。以P ＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 膿毒癥降低大腦中 Sesn2 的激活在CLP手術后7 d，與Sham小鼠相比，CLP小鼠的海馬［（1.00 ± 0.03） vs.（0.34 ± 0.04）］和皮質［（1.00 ±0.02） vs.（0.55 ± 0.05）］中Sesn2顯著下調（P ＜ 0.01）（圖1）。

圖1 各組中海馬和皮質Sesn2的代表性蛋白質印跡和定量數據Fig.1 Representative protein imprinting and quantitative data of seahorse and cortex Sesn2 in each group

2.2 Sesn2激動劑減少CLP小鼠膿毒癥誘導的認知功能障礙和神經功能缺損圖2A顯示CLP組的存活率約為40%。與CLP組相比，CLP+Eupatilin組的存活率顯著增加（P ＜ 0.05）。與Sham組相比，CLP組小鼠表現出相對較高的神經損傷評分（P ＜ 0.05），而CLP+Eupatilin組小鼠的神經損傷評分較CLP組顯著降低（P ＜ 0.05）（圖2B）。與Sham組相比，CLP組小鼠的空間學習能力顯著受損（P ＜ 0.05），而CLP+Eupatilin組緩解了SAE誘導的學習障礙（圖2C、D）。訓練后24 h進行探尋試驗。與Sham組相比，CLP組中的小鼠具有更少的平臺穿越次數（36 ± 3 vs.15 ± 1）和更短的目標停留時間（4.3 ± 0.5 vs.2.2 ± 0.3），而CLP + Eupatilin組中小鼠停留在目標區域時間（25 ± 2 vs.15 ± 1）和平臺穿越次數（3.2 ± 0.3 vs.2.2 ± 0.3）顯著高于CLP組（P ＜ 0.05）（圖2E、F）。

圖2 Sesn2激動劑減少CLP小鼠膿毒癥誘導的認知功能障礙和神經功能缺損（n=8）Fig.2 Sesn2 agonist reduces cognitive dysfunction and neurological deficit induced by sepsis in CLP mice（ n=8）

2.3 Sesn2激動劑減輕膿毒癥誘導的SAE小鼠海馬神經炎癥并激活Sesn2-Nrf2通路尼氏染色的結果顯示，與Sham組相比，CLP組小鼠海馬組織中神經元明顯減少（17 ± 2 vs.9 ± 2，P ＜ 0.05），而CLP + Eupatilin組小鼠海馬組織中神經元較CLP組顯著增加（14 ± 1 vs.9 ± 2，P ＜ 0.05）（圖3A）。透射電鏡顯示，CLP組切片中，線粒體皺縮，膜密度壓縮，嵴減少，外膜破裂更明顯。相反，CLP + Eupatilin組線粒體相對正常，嵴清晰（圖3B）。結果表明，Eupatilin改善了CLP誘導的線粒體功能障礙。免疫熒光分析顯示，與Sham組相比，CLP組小鼠海馬組織中Sesn2和Nrf2的共定位率顯著降低（16.5± 1.8 vs.8.8 ± 1.3，P ＜ 0.05），而CLP+Eupatilin組小鼠海馬組織中Sesn2和Nrf2的共定位率顯著高于CLP組（13.2 ± 1.5 vs.8.8 ± 1.3，P ＜ 0.05）（圖3C）。CLP組CD68/Iba-1陽性小膠質細胞數量顯著增加（1.0 ± 0.1 vs.10.2 ± 1.5，P ＜ 0.05），大量小膠質細胞被激活，呈阿米巴樣，胞體大，突起短，而CLP +Eupatilin組被激活的小膠質細胞數量顯著減少（6.3 ± 0.8 vs.10.2 ± 1.5，P ＜ 0.05）（圖3D）。

圖3 Sesn2激動劑減輕膿毒癥誘導的SAE小鼠海馬神經炎癥并激活Sesn2-Nrf2通路（n = 4）Fig.3 Sesn2 agonist can reduce the inflammation of hippocampus induced by sepsis and activate Sesn2-Nrf2 pathway（ n = 4）

2.4 Sesn2通過Nrf2通路抑制LPS誘導的神經元凋亡和線粒體損傷與Con組相比，LPS組細胞凋亡和MMP水平顯著增加（P ＜ 0.01），而LPS + Eupatilin組細胞凋亡和MMP水平顯著低于LPS組（P ＜ 0.05）。然而，Nrf2敲低（LPS + Eupatilin + si-Nrf2組）逆轉了Eupatilin的抗細胞凋亡作用和線粒體保護作用（圖4A、B）。此外，與LPS組相比，LPS + Eupatilin組細胞中GPX4的表達顯著增加（P ＜ 0.05），和ASCL4的表達顯著降低（P ＜ 0.05）。然而，Nrf2敲低（LPS+ Eupatilin + si-Nrf2組）逆轉了Eupatilin對GPX4、ASCL4的表達影響（圖4C）。

圖4 激活Sesn2-Nrf2通路抑制LPS誘導的神經元凋亡和線粒體損傷（n = 3）Fig.4 Activation of Sesn2-Nrf2 pathway inhibits LPS-induced neuronal apoptosis and mitochondrial damage （n = 3）

3 討論

海馬體是與學習和記憶相關的關鍵區域，對缺血、缺氧和炎癥非常敏感。SAE誘發的認知障礙與神經元功能障礙和海馬突觸可塑性有關［15］。本研究表明CLP導致SAE小鼠海馬出現明顯的病理改變、線粒體功能障礙和膠質細胞活化。此外，CLP小鼠的海馬和皮質中Sesn2顯著下調，而采用Sesn2激動劑Eupatilin治療能顯著減輕CLP誘導的海馬病理損傷，減少小膠質細胞活化和神經炎癥，從而改善SAE的神經功能缺損。這一結果與早期的研究一致，即Sestrin2激活可防止腦缺血再灌注損傷中的鐵死亡，并改善神經功能缺損［16］。此外，Eupatilin治療明顯提高了CLP小鼠海馬組織中Sesn2和Nrf2的共定位率，表明激活Sesn2-Nrf2通路可能涉及SAE的保護機制。

Sestrin2（Sesn2）是Sestrin家族的成員，在各種應激下被誘導，包括缺血、缺氧、高糖、DNA損傷、氧化應激和內質網應激［17］。據報道，Sesn2正調節核因子紅系-2相關因子2（Nrf2）的激活［7，18］。Nrf2被認為是內源性抗氧化防御和線粒體生物發生的主要調節因子，在氧化應激下其通過轉移到細胞核中，并調節細胞核中一系列抗氧化防御基因的表達［19］。研究表明，Nrf2激活劑可以改善膿毒癥大鼠的記憶障礙［20-21］。在體內，我們觀察到Sesn2-Nrf2通路可能在CLP誘導的線粒體功能障礙中起調節作用。線粒體是高度動態的細胞器，經歷不斷的分裂和融合，這些形態變化是有效的能量代謝、鈣緩沖和細胞存活調節所必需的［13］。由于神經元在突觸中的高能量需求，特別容易受到線粒體功能障礙的影響［4］。本研究證實了Nrf2敲低逆轉了Sesn2激活的抗細胞凋亡作用和線粒體保護作用。因此，Sesn2-Nrf2通路可通過抗線粒體功能障礙作用顯著減輕CLP誘導的SAE小鼠的認知功能障礙。

神經元炎癥也是SAE的一個重要特征，組織病理學上與腦功能障礙相關［22］。死亡細胞會釋放炎癥因子，從而放大組織損傷。線粒體功能障礙以及其他類型的調節性壞死是促炎的，然而，線粒體功能障礙癥如何引起炎癥仍不清楚。大量研究表明，小膠質細胞在SAE中起著重要作用，刺激和放大炎癥反應［23］。本研究在CLP海馬組織觀察到CD68/Iba-1陽性小膠質細胞數量顯著增加，大量小膠質細胞被激活，呈阿米巴樣，胞體大，突起短，而Eupatilin顯著減少了激活的小膠質細胞數量。這些發現將微環境串擾與SAE發展聯系起來，并定義了可能作為SAE有效靶點的重要細胞和分子介質。

此外，我們還評估了線粒體功能障礙的其他重要調節因子。首先，氨基酸代謝與線粒體功能障礙密切相關。幾種氧化還原酶利用谷胱甘肽減少脂質活性氧，包括GPX4［24］。其次，雙烯丙基多不飽和脂肪酸（PUFAs）的過氧化作用也是促進線粒體功能障礙的另一個關鍵步驟［25］。在氧化應激下，增加PUFAs的合成可以促進脂質過氧化。酰基輔酶a合成酶長鏈家族成員4（ACSL4）是調節PUFAs合成的關鍵脂質代謝酶。ACSL4首先催化游離花生四烯酸（AA）-CoA之間的生化反應，然后促進它們酯化成磷脂，這是形成磷脂氫過氧化物所必需的。然后ALOX家族（主要是ALOX12）介導PUFA過氧化，導致大量脂質ROS的釋放［25］。研究發現，脂質過氧化與各種神經系統疾病的發生有關，并伴有GPX4水平的降低［8］。本研究表明，Eupatilin能有效增加LPS誘導的海馬神經元細胞（HT22）中GPX4的表達水平，并降低ACSL4的表達水平。基于這些研究，我們推測Eupatilin對SAE的抗氧化活性可能與抑制線粒體功能障礙有關。si-Nrf2轉染的HT22細胞則降低了Eupatilin對LPS的抗線粒體功能障礙作用，導致更嚴重的細胞凋亡和線粒體功能障礙。

總之，本研究證明了Eupatilin通過激活Sesn2-Nrf2通路減輕SAE小鼠的認知功能障礙、神經功能缺損，并且通過減輕線粒體功能障礙來改善炎癥微環境。這些數據有助于我們對SAE后線粒體功能障礙的理解，并為進一步研究提供了有價值的候選靶標信息。然而，因為Eupatilin并非Sesn2的特異性激動劑，目前的結果尚不能完全證明Eupatilin通過Sesn2-Nrf2保護線粒體功能在膿毒癥腦損傷中的作用，未來的研究需要考慮使用Sesn2基因敲除小鼠。