抑制TRAF6調節炎癥和自噬改善膿毒癥小鼠的心肌損傷和心功能

周穎 蔣大軍 田勇 古雍翔 楊國輝，3

1貴州醫科大學臨床醫學院（貴陽 550004）；2黔西南州人民醫院呼吸科（貴州興義 562400）；3貴州醫科大學附屬醫院（貴陽 550004）

膿毒癥心肌功能障礙（sepsis-induced myocardial dysfunction，SIMD）是由膿毒癥引起的整體性的、可逆性的心臟功能障礙［1］。20% ～ 65%的膿毒癥患者合并有心肌功能障礙［2］；當合并膿毒癥心肌功能障礙，死亡風險顯著增加［3］。該病對液體復蘇和血管活性藥物的治療反應性減弱［4］。臨床醫師對該病的治療和管理面臨嚴峻的挑戰。

SIMD的發病機制復雜，目前認為包括有炎癥反應、線粒體損傷、細胞自噬、氧化應激以及細胞凋亡等因素［1］。當機體受到病原體的入侵時，模式識別受體（PRRs）通過識別病原體相關分子模式（PAMPs）和損傷相關分子模式（DAMPs）激活先天免疫活性。腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6）在炎癥信號通路中是一個銜接分子，參與細胞內Toll樣受體4（TLR4）/核因子-κB（NF-κB）信號調控細胞炎癥反應以及細胞自噬信號等生物學過程［5］。自噬（Autophagy）作為維持細胞穩態的一種自我保護機制，在膿毒癥心肌細胞損傷的過程中，細胞利用溶酶體對胞內物質例如功能受損的細胞器、過剩蛋白質、部分病原體、炎癥因子等進行“自我消化”的降解過程，起到了保護細胞損傷及清除受損細胞器的作用［6］。SIMD心肌細胞中強烈的炎癥反應與自噬水平呈不相適應會導致更嚴重的組織器官損傷。通過促進心肌細胞自噬，可以減輕因炎癥損傷導致的心肌功能障礙［7-8］。TRAF6在膿毒癥并發急性肺、腎損傷患者中處于高表達水平［9-10］。何子純等［11］的研究表明在膿毒癥并發ARDS患者自噬處于被抑制狀態。唐晉等［12］通過miR-98-5p負向調控TRAF6的表達減輕肺部的炎癥反應并保護肺泡功能。而抑制TRAF6在膿毒癥心肌損傷中的對心肌細胞自噬作用尚未見報道，本研究擬從促進自噬和抑制炎癥方面探索其發病機制和治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物雄性昆明小鼠，健康清潔級，8周齡，體質量25 ～ 30 g，購于貴州醫科大學實驗動物中心，合格證號：SYXK（黔）2018-0001；實驗符合貴州醫科大學動物實驗倫理規范（批準號：2200656）。

1.1.2 主要試劑及儀器TRAF6特異性抑制劑C25-140（美國MCE），三溴乙醇（南京愛貝生物），TRAF6、p65、p-p65抗體（Affinity），beclin-1、P62、LC3B抗體（Abmart），GAPDH抗體（武漢三鷹），qPCR試劑盒（武漢塞維爾），IL-1β、TNF-α、ELISA試劑盒（江蘇晶美），VINNO 76LAB動物超聲診斷儀（北京益仁）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及模型構建將昆明小鼠按隨機數字表法隨機分4組，每組6只，分別為假手術（sham）組、假手術+C25-140（sham+C）組、CLP組、CLP+C25-140（CLP+C）組。膿毒癥小鼠模型參考課題組前期實驗的盲腸結扎穿刺術（CLP）制模方法，術后24 h出現心肌損傷及心功能障礙，此時心肌細胞自噬處于相對被抑制狀態，故選擇術后24 h作為試驗終點［13］。sham+C組、CLP+C組術后0.5 h予C25-140（10 mg/kg，藥物劑量參考文獻［14］）腹腔注射；sham、CLP組給予等體積生理鹽水。

1.2.2 小鼠心臟功能測定術后24 h麻醉，VINNO76LAB超聲測左室舒張末期內徑（LVEDd）、左室收縮末期內徑（LVEDs），通過Teichholtz公式計算出左室射血分數（LVEF）和左室短軸縮短率（LVFS）［15］。計算方法如下：LVFS（%）=（LVEDd-LVEDs）/LVEDd×100；LVEF（%）=［（LVEDd）3-（LVEDs）3］/（LVEDd）3×100。

1.2.3 血清TNF-α、IL1-β濃度測定取小鼠右側眼眶血離心取血清ELISA測TNF-α、IL1-β樣品濃度。

1.2.4 心肌組織HE染色取左心室最大橫徑冠狀切面的心肌組織HE染色評估各組心肌組織炎性損傷。

1.2.5 心肌組織透射電鏡觀察自噬小體、線粒體微結構于心尖組織約0.1 cm × 0.1 cm × 0.1 cm大小，2.5%戊二醛固定，切片透射電鏡觀察自噬小體、線粒體微結構。

1.2.6 實時熒光PCR測心肌組織中TRAF6 mRNA表達TRAF6引物設計由上海生工生物公司設計，序列從5′-3′所示：TRAF6-F：GGAAGAGCAGTCGTTTCCTG，TRAF6-R：GTCACACCTCTACGGGGAAA；GAPDH-F：GGTTGTCTCCTGCGACTTCA，GAPDH-R：TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC。提取心肌組織總RNA，反轉錄成cDNA。經預變性、變性、退火/延伸、擴增；以2-ΔΔCt算TRAF6 mRNA的相對表達量。

1.2.7 Western blot（WB）測自噬相關蛋白的表達取心肌組織提取蛋白。依據分子量選用10%、12%的SDS-PAGE凝膠，電泳，轉膜，封閉，孵育一抗、二抗，ECL顯影，Image J軟件對條帶灰度值分析。

1.2.8 抑制自噬后觀察C25-140對膿毒癥小鼠心肌損傷的影響為進一步研究自噬在保護膿毒癥小鼠心肌細胞功能中作用，在抑制TRAF6的同時予3-MA抑制自噬，觀察對小鼠心肌損傷和心功能的影響。將昆明小鼠18只隨機分為3組，每組6只，分別為CLP組、CLP+C25-140（CLP+C）組、（CLP+C+3MA）組，術后依據分組腹腔注射C25-140（劑量為10 mg/kg）、3-MA（劑量為10 mg/kg，藥物劑量參考文獻［16］）；CLP給予等體積生理鹽水右側腹腔注射。術后24 h動物超聲及取心肌組織送檢病理。

1.2.9 統計學方法采用SPSS 25.0對數據統計分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差表示，多組間比較單因素方差分析（One-way ANOVA），兩組間比較使用t檢驗。檢驗水準取α = 0.05，以P＜ 0.05為差異有統計學意義。使用GraphPad Prism 9.0繪制統計圖。

2 結果

2.1 腹腔注射C25-140后小鼠心肌組織中蛋白TRAF6和TRAF6 mRNA的表達下降與sham組比較，CLP組心肌組織TRAF6蛋白及mRNA顯著升高（P＜ 0.05）；與CLP組比較，CLP+C組心肌組織TRAF6蛋白及mRNA表達下降（P＜ 0.05）。C25-140對假手術組TRAF6 mRNA和蛋白表達無明顯差異。見圖1。表明術后腹腔注射C25-140能有效抑制膿毒癥小鼠心肌組織TRAF6的表達。

2.2 抑制TRAF6后膿毒癥小鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-1β下降與sham組比較，CLP組血清TNF-α、IL-1β濃度顯著升高（P＜ 0.05）；與CLP組比較，CLP+C組炎癥因子水平下降（P＜ 0.05），sham組與sham+C組組間差異無統計學意義。見圖2。表明術后抑制TRAF6減輕膿毒癥小鼠的炎癥反應。

圖2 抑制TRAF6后膿毒癥小鼠血清炎癥因子TNF-α、IL1-β下降Fig.2 The decrease of serum TNF-α and IL1-β in septic mice after inhibition of TRAF6

2.3 HE染色評估心肌組織病理改變sham組、sham+ C組小鼠心肌組織光鏡下無炎癥細胞浸潤；CLP組炎癥細胞浸潤，心肌纖維排列稍不規則，心肌纖維水腫；CLP+C組心肌纖維輕度水腫、炎性細胞浸潤較CLP組減輕，表明抑制TRAF6減輕心肌炎癥反應。見圖3。

圖3 各組心肌組織病理變化（400 ×，比例尺10 μm）Fig.3 HE staining of myocardial tissue in each group （400 ×，scale 10 μm）

2.4 抑制TRAF6改善膿毒癥小鼠的心臟收縮功能動物超聲檢測左室射血分數（LVEF）、左室短軸縮短率（LVFS）。與sham組比較，CLP組小鼠的LVEF、LVFS顯著指標下降（P＜ 0.05）；CLP術后給予腹腔注射C25-140后LVEF、LVFS較CLP組有改善（P＜ 0.05）。見圖4。

圖4 抑制TRAF6后改善CLP小鼠LVEF、LVFSFig.4 Improvement of LVEF and LVFS in CLP mice after inhibition of TRAF6

2.5 透射電鏡觀察心肌自噬小體、線粒體微結構變化透射電鏡下sham組、sham+C組心肌線粒體排列正常，無腫脹，未見自噬小體；CLP 組小鼠心肌線粒體明顯腫脹，偶見自噬小體；與CLP組比較，CLP+C組線粒體腫脹減輕，自噬小體增多，見圖5。

圖5 透射電鏡觀察心肌細胞自噬小體、線粒體微結構（25 000 ×，比例尺500 nm）Fig.5 Observation of autophagosomes and mitochondrial microstructure of cardiomyocytes by transmission electron microscopy

2.6 WB檢測心肌組織Beclin-1、LC3B、P62自噬相關蛋白的表達CLP+C組與 CLP 組比較，抑制TRAF6后心肌組織中參與自噬起始蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ表達增加，P62減少（P＜ 0.05），表明抑制TRAF6后促進心肌細胞自噬。見圖6。

圖6 Western blot各組小鼠心肌組織Beclin-1、LC3B和P62的表達Fig.6 Expression of Beclin-1，LC3 B and P62 protein in myocardial tissue of mice in each group

2.7 3-MA抑制自噬后減弱了C25-140對膿毒癥小鼠心肌損傷的保護作用與CLP組比，CLP+C組小鼠心肌組織病理炎癥損傷減輕；CLP+C+3-MA組小鼠心肌組織炎癥細胞浸潤，心肌纖維水腫、排列稍不規則，如圖7所示。抑制自噬降低了C25-140對膿毒癥小鼠心肌損傷的保護作用，表明促進自噬是保護膿毒癥心肌損傷的重要因素。

2.8 3-MA抑制自噬后減弱了C25-140對膿毒癥小鼠心功能的保護作用超聲檢測小鼠心功能，如圖8所示，與CLP組比較，CLP+C組小鼠的LVEF、LVFS升高（P＜ 0.05）；與CLP+C組比較，CLP+C+3-MA組小鼠LVEF、LVFS下降（P＜ 0.05）。抑制自噬降低了C25-140對膿毒癥小鼠心功能的保護作用。

圖8 抑制自噬小鼠的LVEF、LVFS下降Fig.8 Inhibition of autophagy leads to the decrease of LVEF and LVFS in mice

3 討論

心臟是膿毒癥常見累及的靶器官，當膿毒癥合并心功能障礙，病死率可高達70%，是ICU膿毒癥患者死亡的重要原因之一［17］。炎癥反應是膿毒癥病理生理發生的核心環節。本實驗采用盲腸結扎穿刺術（cecal ligation and puncture，CLP）是構建膿毒癥研究的常用模型之一，更接近于臨床上膿毒癥的炎癥特征。CLP術后24 h檢測心肌組織中TRAF6蛋白以及mRNA顯著升高；血清TNF-α、IL1-β濃度顯著升高；心肌組織病理可見心肌纖維水腫，炎癥細胞浸潤；動物超聲多普勒檢測LVEF、LVFS明顯下降，說明膿毒癥心肌功能障礙模型建立成功；透射電鏡觀察偶見自噬小體、線粒體腫脹明顯，自噬處于相對被抑制狀態。CLP術后腹腔注射TRAF6特異性抑制劑C25-140后，實驗結果表明，WB以及PCR檢測心肌組織中TRAF6表達降低，炎癥因子下降；心功能指標LVEF、LVFS升高；病理提示心肌炎癥減輕；透射電鏡觀察自噬小體增多，自噬蛋白Beclin-1、LC3II/I表達增加，自噬效應增強。而自噬抑制劑3-MA減弱了C25-140對心肌的保護作用。

TRAF6是一種銜接蛋白，參與腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor，TNFR）家族和Toll樣受體（Toll-like Receptor，TLR）/白細胞介素-1受體（interleukin-1 receptor，IL-1R）家族信號轉導的連接［18］。TLR4作為最早發現的Toll樣受體家族成員之一，在心臟組織中高表達，參與心肌炎癥、心功能衰竭等疾病的發生發展過程。TLR4激活下游信號TRAF6，進一步激活NF-κB信號通路，產生TNF-α、IL-1β等炎癥因子。本研究選擇使用TRAF6特異性抑制劑C25-140具有抑制NF-κB信號通路降低炎癥反應的作用［14］；但在膿毒癥心肌功能障礙中無相關報道。CLP術后經腹腔注射TRAF6特異性抑制劑后，阻斷炎癥信號通路的關鍵環節，小鼠的血清炎癥因子下降，表明抑制TRAF6減輕膿毒癥的全身炎癥反應。

心臟是膿毒癥常見受累的靶器官，膿毒癥的嚴重炎癥反應產生大量炎癥因子等心肌抑制物質是SIMD形成的基礎；TNF-α、IL-1β等炎癥因子導致心肌細胞炎性水腫、氧化應激、鈣穩態失調、線粒體功能障礙等加重心肌細胞功能紊亂，進而引起心肌組織損傷和心功能障礙［1］。SUN等［19］的研究使用橘皮苷顯著降低LPS誘導膿毒癥小鼠心功能障礙模型的炎癥因子（TNF-α、IL-1β）和心肌酶（CK、LDH）的水平，減輕了心肌組織的炎癥反應和心臟功能障礙。本實驗使用特異性抑制劑C25-140抑制TRAF6，抑制NF-κB炎癥信號通路的上游關鍵節點，HE染色觀察心肌病理炎性細胞浸潤減少，心臟收縮功能LVEF、LVFS有所好轉，改善心肌炎癥損傷及膿毒癥小鼠的心臟功能。本實驗透射電鏡檢查見CLP組小鼠心肌組織微結構自噬小體數目減少、線粒體腫脹。線粒體占心肌細胞的30%，是心肌收縮和舒張功能能量產生的場所，線粒體功能障礙是SIMD廣泛認同的發病機制之一。PENG等［20］研究，迷迭香酸（RA）通過激活Sirt1/PGC-1α通路減輕線粒體損傷改善LPS誘導的心臟功能障礙。JOSEPH等［21］抑制NOX2維護線粒體功能和保持細胞內鈣穩態，減輕膿毒癥誘導的心臟收縮功能障礙。本實驗觀察到抑制TRAF6后CLP小鼠線粒體腫脹減輕，具有保護線粒體功能的作用。

自噬在調節膿毒癥免疫細胞炎癥反應中起著關鍵性作用，在膿毒癥早期即可參與清除病原體、受損細胞和細胞器的修復、回收、再利用等調節過程，減輕心肌的損傷［6］。維持適當的自噬水平是決定細胞在應激反應中保持正常功能的關鍵。在膿毒癥早期，自噬水平與膿毒癥嚴重狀態相適應，當膿毒癥病情逐漸加重，自噬受到抑制。LINARES等［22］研究表明，在營養激活的細胞實驗中TRAF6促進mTORC1的激活。GAO等［23］研究表明，雷帕霉素抑制mTORC1促進自噬改善慢性心力衰竭大鼠模型的心肌細胞凋亡和心臟功能。因此，進一步推測TRAF6促進mTORC1的激活負調節自噬信號通路抑制心肌細胞自噬過程。TANG等［8］研究，納西克拉辛（Narciclasine）促進自噬上調緩解LPS誘導膿毒癥急性心肌損傷。CHEN等［24］在脂多糖誘導的膿毒癥小鼠心肌病模型中觀察到丹參酮IIA磺酸鈉增強自噬抑制NLRP3減輕膿毒癥心肌病模型小鼠的炎癥反應和心功能障礙。本實驗抑制TRAF6后WB檢測心肌組織Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ表達增加，P62減少，結合透射電鏡觀察心肌組織自噬，表明自噬增強后緩解膿毒癥所致的炎癥反應和心功能障礙，當給予自噬抑制劑后部分逆轉了C25-140對心肌損傷的保護作用。因此，抑制TRAF6促進自噬參與改善膿毒癥心肌炎癥和心功能障礙的病理生理過程。

本實驗使用動物超聲多普勒檢測心臟功能，接近于臨床診斷SIMD的客觀依據。也存在不足，僅僅在動物模型層面觀察心肌炎癥和心臟收縮功能，還需通過心肌細胞實驗驗證不同方案的療效差異。其次，由于實驗經費等限制，未進一步深層次直接探索抑制TRAF6后自噬信號通路中關鍵靶蛋白的變化。綜上所述，本研究論證抑制TRAF6后對膿毒癥小鼠心肌的炎癥損傷和心功能障礙的治療效果，并且觀察到抑制TRAF6增強膿毒癥小鼠心肌細胞自噬水平，抑制自噬減弱了C25-140對膿毒癥小鼠心肌損傷的保護作用，為膿毒癥心肌功能障礙在治療方面提供抑制炎癥和促進自噬聯合應用的線索依據。