小麥籽粒鎘元素含量全基因組關聯分析及候選基因預測

王健勝 時夏 周正富 馬愛鋤 王二偉 侯桂玲 晁岳恩 李文旭 王亞歡 吳政卿 雷振生

摘 要 以國內外207份小麥種質為材料，利用660K SNP芯片對其進行基因型檢測，并結合不同環境下表型數據和最佳線性無偏預測值 （BLUP，Best linear unbiased prediction） 對小麥籽粒鎘元素含量進行全基因組關聯分析。結果表明：與小麥籽粒鎘元素含量顯著關聯的SNP 310個，這些SNP分布于除3D和4D外的19條染色體上，單個SNP解釋變異率為10.95%～14.66%。不同環境下檢測到的關聯SNP結果存在差異，其中在原陽地區檢測到186個SNP，開封地區檢測到71個SNP。基于BLUP值分析獲得53個SNP。基于SNP物理位置，將距離較近的SNP進行整合，共獲得有效QTL位點52個。同時發現了7個在多環境下表現穩定的SNP，并對其進行單標記效應分析。最后對基于獲得的關聯SNP進行了候選基因預測，共獲得7個與小麥籽粒鎘元素含量相關的候選基因，其中 TraesCS1B01G321700和TraesCS1B01G320200可能與鎘元素調控相關基因轉錄有關，而TraesCS7B01G459000和TraesCS7B01G456900可能與鎘元素的吸收和轉運等代謝過程有關。還篩選出了對鎘具有良好避性的部分小麥優異種質，如‘云麥51‘鄭麥379‘白穗白‘云麥53‘雙豐收。

關鍵詞 小麥；Cd含量；SNP芯片；全基因組關聯分析

品質安全是小麥生產的重要前提，也是保障國民健康的基礎。然而近年來隨著環境污染問題的日益凸顯，重金屬污染已經成為影響小麥品質及小麥安全生產的主要因素之一［1-6］。鎘是環境中常見的重金屬，也是人體非必需元素，進入人體的鎘會在腎、肝等器官蓄積并引起相關疾病［7］。一般而言，鎘主要存在于土壤、水等環境介質中，這些鎘會被小麥吸收并轉移至籽粒等食用組織器官［8-9］，故開展小麥籽粒鎘含量分析并探索其遺傳控制機制是保障小麥品質安全的重要課題，其已經引起國內外研究者的重視［10-11］。但國內有關小麥籽粒鎘遺傳機制研究報道甚少，只有國外學者在此方面開展了部分研究。Yusuke等［12］利用Chugoku 165×Chukei10-22的DH群體對小麥籽粒中鎘濃度進行了QTL定位，在4B和6B染色體上檢測到兩個穩定且遺傳效應顯著的QTL。Safdar等［13］利用90 K SNP芯片對120個春小麥種質組成的關聯群體進行了籽粒鎘含量分析，結果在1A、1D、2B和6D上共檢測到5個與鎘吸收顯著關聯的QTL位點。Hussain等［14］利用關聯分析方法在小麥2A和2B染色體上發現2個與籽粒鎘元素濃度相關的QTL。也有部分學者開展了小麥鎘相關基因的研究［15-16］。基于此，本研究以國內外收集的207份小麥種質為材料，利用小麥660K SNP芯片進行了小麥籽粒鎘濃度的全基因組關聯分析，以期為小麥鎘含量控制及優異抗鎘新品種培育提供一定科學基礎和有效材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及其田間種植

本研究關聯分析群體共包含207個小麥種質/品種，其來自8個國家，包括中國、俄羅斯，法國、保加利亞、羅馬尼亞、墨西哥、澳大利亞和日本，國內的小麥種質均來自中國主要小麥種植區（包括陜西、甘肅、河南、北京、四川、山東、貴州、河北、江蘇、山西、云南、安徽、湖北、寧夏和黑龍江）。這些小麥材料主要由審定品種、地方種質以及國外引進的小麥品種或種質組成（表1），均由河南農科院小麥研究所提供。2017-2018年將關聯分析群體分別種植于河南省開封和原陽，這兩個地區是河南省小麥主要種植區域，其土壤總鎘含量平均分別為0.23 mg/kg（開封）和0.37 mg/kg（原陽）［17］。各試驗點田間均采用隨機區組設計，每個小麥材料種植3行，行長2 m，行距25? cm，株距10? cm，設3次重復。試驗田土壤肥力中等，田間管理按照當地常規栽培管理標準進行。

1.2 鎘元素含量測定

小麥籽粒收獲及預處理：待小麥自然成熟后，按小區混收。收獲的小麥籽粒自然充分晾干，取一定量籽粒用小型粉碎機粉碎，經孔徑0.15 mm篩子過篩后，稱取0.50 g 樣品放入50 mL微波消解管中，加入一定量的硝酸和過氧化氫，混勻后放入微波消解儀進行消解，最后充分過濾消解液并用1%硝酸溶液定容至50 mL。

小麥籽粒鎘元素含量測定：首先利用鎘 ?（1 mg/kg）元素標準溶液分別配制0.02 mg/kg、 ?0.05 mg/kg、0.10 mg/kg、0.20 mg/kg 4個濃度梯度溶液，利用日本島津原子吸收分光光度儀 AA-6300，采用火焰-原子吸收法測定其吸光度，構建鎘元素的標準曲線。基于構建好的鎘元素標準曲線，采用同樣方法分別測定小麥種質籽粒的鎘元素含量，每個小麥樣品重復測定3次，取平均值作為每個材料籽粒鎘元素含量。

1.3 基因型檢測

在小麥幼苗期采集葉片利用改良的SDS法提取DNA［18］，利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢驗DNA質量。利用博奧晶典生物技術有限公司小麥660 K iSelectSNP 芯片對207份小麥材料進行SNP分型，同時對分型結果進行質量控制，剔除數據缺失率＞2%、雜合率＞50%和最小等位基因頻率（Minor allele frequency，MAF）＜0.05的 SNP 標記，最終獲得多態性高、穩定性好高質量SNP 標記244 508個，這些標記將被用于后續關聯分析。

1.4 全基因組關聯分析

基于Tassel v5.0軟件中的GLM （Generalized Linear Model） 模型［19］，結合已獲得的關聯群體基因型數據及其表型數據，對207份小麥種質籽粒鎘元素含量進行關聯分析。分析中，當 ?P≤0.001時，認為該SNP標記與性狀顯著關聯，并計算該標記位點對表型變異的貢獻率。利用Rstudio軟件繪制曼哈頓圖和Quantile-Quantile 散點圖［20］，每個位點的顯著性則通過曼哈頓圖來展示。

1.5 候選基因預測

以 LD 距離作為候選基因的預測區間，以與鎘元素含量顯著關聯的 SNP 標記序列為探針，在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov；National center for biotechnology information）和 ENA（European Nucleotide Archive；http：//www.ebi.ac.uk/ena）數據庫中進行Blast比對，獲得鎘元素含量相關的候選基因，并對部分候選基因進行功能注釋。

2 結果與分析

2.1 小麥種質籽粒鎘元素含量分布狀況

關聯分析群體包含的207份小麥種質籽粒鎘元素含量在不同環境下變化較大。從圖1和表1可知，在開封地區，不同小麥種質鎘元素含量分布在0.03～2.19 mg/kg，平均值為0.92? ?mg/kg，其標準差為0.46，表明在該環境下關聯分析群體的鎘元素含量變異較大。與開封地區相比，關聯分析群體鎘元素含量在原陽地區無論變異程度還是平均值方面均相對較小，其變化范圍為0.07～ ?1.44 mg/kg，鎘元素平均含量為0.55? mg/kg，標準差為0.31。從偏度和峰度值看，兩個環境下關聯群體鎘元素含量均呈偏態分布，相對而言開封環境下鎘元素含量更接近正態分布。另外，研究利用不同環境獲得了該群體最佳線性無偏差預測值（BLUP），可以發現，群體鎘元素含量的BLUP值表現較好。從小麥種質在不同環境下的綜合表現來看，有個別小麥種質鎘元素含量較低且表現穩定，表現最突出的種質為‘云麥51，其在原陽環境下的鎘元素含量只有0.07 mg/kg，在開封環境下鎘元素含量為0.10?? ?mg/kg。表現比較突出的還有‘鄭麥379‘白穗白‘云麥53‘雙豐收等，這些種質將在未來選育對鎘具有良好避性的小麥新品種中具有較好利用前景。

2.2 小麥籽粒鎘元素含量GWAS分析

基于660K SNP芯片本研究共檢測到與鎘元素含量顯著相關的SNP 310個，這些SNP分布在除3D和4D以外的19條染色體上。不同染色體上SNP數量存在較大差異，其中5B染色體上最多，有141個，2B、2D和7D染色體上最少，都只有1個（圖2）。檢測到的SNP對鎘元素含量的解釋變異率表現均較好，單個SNP的解釋變異率均超過10%，介于10.95%～14.66%，其中5B染色體上位于692 510 863 bp處的SNP（AX-111038088）、位于692 511 047 bp處的SNP （AX-109544279）和位于692 511 175 bp處的SNP（AX-108797374）均具有最高的變異解釋率 ?（14.66%）。不同環境下檢測到的關聯SNP也存在較大差異。其中在原陽環境下檢測到186個關聯SNP，這些SNP解釋變異率分布在10.95%～14.66%；開封地區共檢測到顯著關聯SNP 71個，單個SNP的解釋變異率介于11.70%～ ?13.48%。利用BLUP值共檢測到顯著SNP 53個，這些SNP解釋變異率范圍為11.74%～ ?13.37%。可以看出，在原陽環境下檢測到的關聯SNP數量遠高于另外兩種環境，這可能與兩個地區土壤鎘含量差異有關，原陽地區土壤鎘含量比開封高，較高鎘的土壤環境可能更有利于形成小麥籽粒中鎘含量的豐富變異。

多環境下均能檢測到的穩定SNP對小麥Cd元素遺傳及應用研究更具意義。本研究共檢測到7個穩定SNP，分別是1B染色體上位于 ?546 447 821 bp處的AX-109947438、3B染色體上位于737 764 644 bp處的AX-94568844、5B染色體上位于275 179 328 bp處的AX-111054376、5B染色體上位于398 809 332 bp處的AX-110470884、5B染色體上位于399 033 284 bp處的AX-110994155、7A染色體上位于715 775 570 bp處的AX-110746365和7B染色體上位于 ?716 293 661 bp處的AX-109921835，后期應加強對這些穩定SNP 的深入研究。同時，研究基于SNP物理位置將距離較近的SNP整合為QTL，共獲得52個有效QTL （表3）單個QTL包含的顯著SNP數量存在較大差異，介于1 ～ 101。檢測到的與Cd含量相關的QTL在不同染色體上的分布也不均衡，其中3B和6A染色體上檢測到的QTL最多，分別達到了6個，1D、2B、2D、6B、7A和7D染色體上均只發現1個QTL。Cd元素含量QTL在不同環境下數量也有差異，其中在原陽共檢測到23個QTL，開封共檢測到25個QTL。

2.3 穩定遺傳SNP的效應分析

基于上述發現鎘元素關聯的7個穩定SNP，研究對其進行了單標記效應分析。從圖3和表2可以發現，不同SNP優勢等位變異在關聯分析群體所占比例差異明顯。其中AX-109947438、AX-110746365和AX-109921835優勢等位變異在關聯群體中占有比例較低，均小于20%，而AX-111054376、AX-110470884和AX-110994155的優勢等位變異在群體中所占比例均較高，超過80%，只有AX-94568844的優勢等位變異與非優勢等位變異在群體中所占比例較為接近。分析同時發現，對小麥籽粒鎘元素含量而言，7個SNP的優勢等位變異均為非優異等位變異，而非優勢等位變異均是優異等位變異，比較后發現，攜帶SNP非優勢等位變異的小麥種質比攜帶優勢等位變異的小麥種質其籽粒鎘元素含量平均降低 ?0.03～0.05? mg/kg。7個SNP中AX-110994155非優勢等位變異的效應最突出（降低鎘元素含量 ?0.05? mg/kg），其次是AX-109921835（降低鎘元素含量0.04? mg/kg）。另外，研究也對不同環境下7個SNP等位變異的表型效應進行了差異性比較分析，可以發現，除AX-109947438在原陽環境、AX-111054376在開封環境外，7個SNP等位變異的鎘元素含量差異均達到了顯著性水平。

2.4 候選基因分析

本研究共獲得鎘元素相關基因277個，這些基因主要分布在1B、3B、5B、7A、7B染色體上，通過對這些基因在小麥不同組織（根、葉片、穗部和籽粒）中表達分析比較，篩選到只在小麥籽粒中特異表達的候選基因7個，具體信息詳見表3。其中， TraesCS1-B01G320200可能編碼RNA聚合酶Ⅱ轉錄亞單位12G調節因子，而該調節因子影響RNA聚合酶Ⅱ行使轉錄功能的關鍵環節。TraesCS7B01G456900可能編碼線粒體中ATP合成酶的有關亞基，該亞基對ATP的正常生物合成有影響。TraesCS7B01G459000可能編碼類似LEUNIG的G蛋白，該蛋白可以與鎘離子結合有利于鎘的吸收與轉運。TraesCS1B01-G321700可能編碼戊二酸甲酸氨基轉移酶，該酶參與植物中葉酸的代謝，而葉酸對于葉綠素和木質素的合成是必須的。候選基因TraesCS3B01G493300、 TraesCS3B01G493400和TraesCS3B01G493500功能尚不清楚。

3 討? 論

為了減少重金屬鎘對小麥品質的影響，小麥抗鎘育種中應重點選擇對環境中鎘吸收少的小麥材料進行研究利用。因此對現有小麥種質籽粒鎘元素含量調查及篩選是一項重要的基礎性工作，但前期有關此方面研究報道較少。為此，本研究采用原子吸收法對國內外207份小麥種質籽粒的鎘元素含量進行了測定，結果發現，不同小麥種質籽粒鎘元素含量差異較大，而且環境條件對籽粒鎘元素含量有一定的影響。在本研究試驗種植的兩個地區，開封地區種植的小麥種質鎘元素含量相對較高，平均含量達到了0.92? mg/kg，而原陽地區小麥種質鎘元素含量相對較低，平均為0.55? mg/kg，該結果可能是兩個地區土壤環境的差異所致。同時發現，小麥籽粒鎘元素平均含量均超過當地土壤鎘元素平均含量，這可能與鎘在小麥籽粒中的富集效應有關。在鎘元素抗性小麥品種選育中，篩選鎘元素含量低的小麥種質尤為重要，本研究獲得了鎘元素較低的部分小麥種質，例如，‘云麥51‘鄭麥379‘白穗白‘云麥53‘雙豐收，這些種質鎘元素含量不僅低且其在不同環境下表現穩定，這表明這些種質在不同環境下對鎘元素均具有較少吸收，說明這些種質對土壤鎘具有良好的避性。下一步可以選擇其作為親本配制雜交來選擇培育抗鎘優良小麥新品種。

眾所周知，鎘元素含量是受多基因控制的數量性狀，而全基因組關聯分析是解析數量性狀遺傳機制的有效途徑之一。但截至目前，國內外有關小麥鎘元素關聯分析的研究仍較少。近年來小麥SNP芯片作為一種有效手段已被廣泛應用于小麥重要基因定位及相關研究中［21-24］。本研究利用小麥660K SNP芯片對國內外207份小麥種質

籽粒鎘元素含量進行了全基因組關聯分析，結果共檢測到與鎘元素顯著關聯SNP 310個，與前人研究［12-14］相比，本研究檢測到了更豐富的與鎘元素顯著關聯的SNP。推測可能由于以下兩方面原因所致，一方面可能與本研究的關聯分析群體構成特點有關。本研究關聯群體的種質來源較為豐富，其不僅包含了國內15個不同生態區的小麥種質，也包括一些國外小麥種質，豐富的小麥種質可能蘊藏更多的遺傳變異。另一方面，660K SNP芯片的利用為鎘元素更多遺傳位點的檢測發現創造了條件。遺傳圖譜構建中分子標記密度直接影響目標性狀顯著關聯位點檢測的數量和準確性。在本研究中，660K基因芯片提供了可用于關聯分析的有效SNP標記共244 508個，每個連鎖群SNP標記數量平均在11 000個以上，該圖譜有利于提高鎘元素關聯遺傳位點的檢測效率。

本研究對檢測到的小麥鎘含量QTL與前人研究結果進行了比較。在1A染色體上，本研究發現1個QTL，其位于504 277 686 bp處。Safdar等［13］在該物理位置附近的462 435 832 bp處也發現了1個QTL，同時Safdar和本研究在1D染色體上也均檢測到了QTL，Safdar發現的1個QTL位于1D染色體上的14 985 862 bp處，而本研究檢測的1個QTL位于907 312 bp～ ?5 519 062 bp區段，可以看出，兩個研究在1D染色體上發現的QTL距離較遠。本研究在2A染色體的36 196 690 bp～83 784 774 bp區段共發現了3個QTL，Hussain等［14］在該染色體上也發現了1個QTL，但其物理位置與本研究的QTL較遠，位于2A染色體的715 333 165 bp～ ?717 146 211 bp物理區段。Hussain等［14］在5A染色體上檢測到了1個QTL，該QTL位于 ?580 939 178 bp～? 581 302 317 bp區段內，本研究在5A染色體上發現了2個QTL，其分別位于427 202 113 bp和510 096 323 bp處，可以看出，兩個研究發現的QTL物理位置相差較遠。Hussain等［14］在2B染色體上696 677 568 bp～ ?701 097 263 bp處檢測到1個QTL，本研究在該染色體上707 178 993 bp處發現1個QTL，兩個QTL距離較近（約6 Mb）。另外，由于前人部分研究結果并未顯示QTL準確物理位置信息，因此本研究只能和其進行粗略比較。例如，本研究在4B染色體的13 280 997 bp和642 231 359 bp處分別檢測到1個QTL，在相同染色體上Yusuke等［12］卻發現了7個QTL，但其處于 ?37.0 cM～51.3 cM遺傳區段內，在6B染色體上Yusuke等檢測到了7個QTL，而本研究只發現了1個QTL。可以看出，本研究發現的多數QTL在以前研究中并未發現，雖然少數QTL與以前報道的QTL位于相同染色體上，但其物理位置仍較遠。當然通過比較，我們也發現了富含小麥鎘含量QTL的較重要染色體，如1A、3B、5B和6A染色體，下一步應加強對這些染色體上QTL的深入研究。

候選基因分析可以有效揭示小麥籽粒鎘元素含量遺傳調控機制，為培育抗鎘元素小麥良種提供科學支撐。故在獲得小麥籽粒鎘元素含量顯著關聯SNP的基礎上，本研究也開展了鎘元素候選基因的預測分析。共獲得了7個與鎘元素相關的候選基因，這些基因主要通過編碼與鎘元素代謝相關蛋白或其調節因子而影響小麥籽粒鎘元素含量。小麥植株體內的鎘元素主要來源于其生長的土壤環境，這些進入植株體的鎘元素都要經歷吸收、分配、轉運、跨膜等復雜代謝過程才能到達小麥籽粒，而這些代謝過程又有涉及到很多相關因子的參與，通過調節這些因子的功能或活性進而對小麥籽粒鎘元素含量影響。可以發現，本研究獲得的部分候選基因與鎘元素代謝不同因子有關。RNA聚合酶Ⅱ在真核生物中負責所有mRNA的生物合成，亞單位12G是其重要的組成部分［25-26］，而亞單位12G的調節因子對RNA聚合酶Ⅱ完成基因轉錄功能產生影響［27］，TraesCS1B01G320200可能通過調控RNA聚合酶Ⅱ轉錄亞單位12G的調節因子而影響相關基因的轉錄，同時對與鎘元素代謝相關mRNA合成產生影響，最終使小麥籽粒鎘元素含量發生變化。ATP合成酶由多種亞基組成，主要負責為植物各種代謝活動提供所需能量，而亞基對ATP合成酶的功能會產生直接影響［28-29］，植物對鎘元素的吸收和轉運等過程是需要能量的，而 TraesCS7B01G456900可能通過編碼線粒體中ATP合成酶的有關亞基進而對ATP生物合成產生影響，進而影響鎘元素的相關代謝過程及其在小麥籽粒中的累積。在生物對鎘的吸收與轉運過程中，生物體內能與鎘有效結合的特異蛋白發揮著重要作用，目前已有類似蛋白被發現［30-31］，本研究發現的TraesCS7B01G459000基因可能編碼可以與鎘結合的相關蛋白，其對籽粒中鎘含量產生影響。TraesCS1B01G321700編碼戊二酸甲酸氨基轉移酶，關于該酶的研究絕大多數集中于動物方面，其在植物中的研究報道較少，在植物中戊二酸甲酸氨基轉移酶主要與葉酸的合成代謝有關，而葉酸不僅對于植物葉綠素和木質素合成較為關鍵［32］，同時也參與甘氨酸和絲氨酸的相互轉化過程，該過程在植物光呼吸中是非常重要的［33］。可以看出，該基因通過對相關物質合成及生理代謝過程的間接調節，進而對鎘吸收代謝產生影響。可以看出，鎘元素候選基因通過編碼相關蛋白或其組成因子進而影響鎘元素在植物體內的代謝，而作為植物重要組織器官的籽粒，其鎘元素含量也會受到這些代謝過程的影響。由于本研究是有關小麥籽粒鎘含量遺傳的初步探索，下一步需要針對發現的候選基因繼續進行特異分子標記的開發并將其在不同小麥群體中進行驗證。本結果將為小麥鎘元素遺傳調控機制解析提供一定研究基礎。

4 結? 論

本研究利用660 K SNP芯片對國內外207份小麥種質籽粒鎘元素含量進行了全基因組關聯分析，檢測共發現了310個顯著關聯SNP位點，這些SNP分布于除3D、4D外的19條染色體上，單個SNP平均解釋變異率介于10.95%～ ?14.66%。研究同時發現了7個在多環境下表現穩定的SNP，并對其進行了單標記效應分析。最后研究獲得7個與小麥籽粒鎘元素含量有關的候選基因，這些基因的功能均與小麥吸收、轉運等鎘元素代謝過程有關。研究也篩選獲得了籽粒鎘含量較低的小麥種質，如‘云麥51‘鄭麥379‘白穗白‘云麥53‘雙豐收等，這些種質將在未來選育對鎘具有良好避性的小麥新品種中具有較好利用前景。

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Genome-Wide Association Analysis and Candidate Gene Prediction of Wheat Grain Cd Concentration

Abstract Cadmium （Cd） is a heavy metal that adversely affects the quality of wheat，and breeding Cd-resistant wheat is crucial. In the present study，a genome-wide association study （GWAS） was conducted in Cd content in wheat grains using the wheat 660 K genotyping assay and a diverse panel of 207 wheat accessions. A field trial was conducted in two locations in 2017. A total of 310 SNPs significantly associated with Cd content were identified，which distributed on 19 wheat chromosomes except for 3D and 4D. The phenotypic variation explained by each SNP varied from 10.95% to 14.66%. The number of significant SNP varied across the different environments，of which 186 SNPs and 71 SNPs were found in Yuanyang and Kaifeng，respectively. Fifty-three significant SNPs were also identified based on the BLUP value. Furthermore，the adjacent SNPs based on the marker physical locations were integrated to the same QTL，finally，52 effective QTLs were obtained，seven significant SNPs were also repeatedly detected under two environments and the BLUP value，and their genetic effect on Cd content was analyzed. In addition，seven candidate genes were predicted for Cd content in wheat grains，of which?TraesCS1B01G321700 and?TraesCS1B01G320200 were possibly associated to the transcription of genes，whereas TraesCS7B01G459000 and TraesCS7B01G456900 possibly had the functions on the absorption and transportation of Cd in wheat. Finally，we identified some elite wheat germplasms with good Cd avoidance，including Yunmai 51，Zhengmai 379，Baisuibai，Yunmai 53.

Key words Wheat; Cd concentration; SNP array; Genome-wide association analysis