miR-421和miR-196b-3p在胃癌癌前病變和早期胃癌診斷中的潛在價值*

王文怡,余靜恬,甘 程

武漢科技大學附屬天佑醫院檢驗科,湖北武漢 430000

胃癌是全球主要癌癥之一[1]。由于缺乏腫瘤標志物和特定的癥狀和體征,通常在診斷時已經轉移[2]。研究表明,晚期胃癌患者的預后較差,5年生存率低于25%[3]。然而,如果在癌前病變或早期階段進行干預和治療,5年生存率將上升至85%以上[4]。因此,尋找可靠且非侵入性的生物標志物用于胃癌的早期檢測和大規模篩查具有重要的臨床意義。微小RNA(miRNA)是不編碼蛋白質的18～25個堿基的RNA。由于它們的穩定性和可重復性較高,已經成為某些癌癥最具潛力的生物標志物之一[5]。胃癌和各種miRNA之間的聯系已在大量研究中被證實[6-7]。然而,關于胃癌癌前病變中miRNA的表達尚未得到充分驗證,也缺乏微陣列進行全面分析的報告。本研究使用血液標本進行了微陣列試驗,重點篩查在慢性萎縮性胃炎(胃癌癌前病變)和早期胃癌患者中特征性表達的miRNA,并分析不同miRNA在胃癌癌前病變和早期胃癌診斷中的價值和意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究經本院醫學倫理委員會批準(201810-017)。(1)發現集:于2018年12月1日至12月31日采集早期胃癌患者3例(早期胃癌組)的血漿標本,另外按照年齡和性別相匹配原則,簽署知情同意書后,招募3例胃癌癌前病變患者(癌前病變組)和3例健康志愿者(NC組),采集血漿標本用作miRNA微陣列分析。(2)驗證集:于2019年1月1日至2023年1月1日共采集90例胃癌患者(胃癌組)、89例癌前病變患者(癌前病變組)的血漿標本。所有患者都接受了胃腸鏡檢查或其他檢查(包括消化內鏡、計算機斷層掃描或內鏡超聲檢查),并經活檢標本的病理檢查證實為癌前病變或胃癌。癌前病變組包括低度上皮內瘤變51例和中度上皮內瘤變38例。另外,根據國際癌癥控制聯盟(UICC)腫瘤-淋巴結轉移(TNM)系統第8版[8]確定胃癌分型和分期:Ⅰ期16例,Ⅱ期19例,Ⅲ期31例和Ⅳ期24例。早期胃癌是指局限于胃黏膜層或黏膜下層的癌組織,不論其范圍大小或是否有淋巴結轉移,即TNMⅠ/Ⅱ期。接受手術、放療或化療的患者被排除在本研究之外。另外按照2∶1和年齡、性別相匹配的原則納入45例健康志愿者(NC組)。所有符合條件的受試者都同意參與本研究,并獲得了有關年齡和性別的信息。將采集用于體檢的血液標本殘留(約2 mL)用于miRNA分析。

1.2方法

1.2.1血漿制備和儲存 立即使用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管收集每個參與者靜脈血4 mL,2 h內以3 000 r/min離心5 min,防止細胞核酸污染。將轉移到無RNase/DNase試管中的上層血漿儲存在-80 ℃直至分析。分離用于常規腫瘤標志物測定的血漿樣品,保存在-20 ℃直至測定。

1.2.3來自公共數據庫的癌癥組織的miRNA表達數據 使用TCGA癌癥數據集(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/),比較了95例正常胃黏膜組織和441例胃癌組織中miRNA的表達。并從Broad研究所開發的Firehose軟件中獲得了基因和miRNA的單核苷酸多態性(SNP)陣列數據。使用ASCAT算法和R軟件3.3.2版從SNP陣列數據計算miRNA的拷貝數。

1.2.4驗證集中提取miRNA和qRT-PCR檢測 使用血液(血清/血漿)miRNA提取和純化試劑盒(離心柱,上海諾倫生物醫藥技術有限公司)從200 μL血漿中分離miRNA。使用NanoQ微量分光光度計(博奧生物集團有限公司)定量血漿miRNA水平。qRT-PCR的初始模板為2 μL。使用一步法Stemaim-it miR qRT-PCR試劑盒定量(Taqman探針,上海諾倫生物醫藥技術有限公司)測定循環miRNA表達,而miR-16作為參考miRNA。在ABI-7500 PCR系統上檢測靶miRNA水平,并使用SDS 2.0軟件(美國應用生物系統)通過循環閾值(Ct)值計算。Ct值大于32的樣品被排除在外。miRNA水平用2-ΔΔCt方法標準化。

1.2.5驗證集常規腫瘤標志物檢測 根據羅氏公司試劑盒和羅氏E170全自動免疫分析儀的標準程序,通過電化學發光免疫測定法對常規腫瘤標志物鐵蛋白、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、CA211、CA50、CA125、CA199、CA153、CA242、CA724進行檢測。

1.3統計學處理 所有數據均使用SPSS26.0和GraphPad Prism 7.0進行分析。非正態分布的計量資料以M(P25,P75)表示,多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗,多組間兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗。繪制受試者工作特征(ROC)曲線評估每種腫瘤標志物的診斷價值。最佳截斷值使用最大約登指數確定。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1發現集miRNA微陣列分析結果 對發現集血漿標本進行了miRNA微陣列分析,在P<0.05和q<0.2條件下的分析結果顯示,分別有44個、136個和45個miRNA在NC組和癌前病變組、NC組和早期胃癌組、癌前病變組和早期胃癌組間表現出差異表達(P<0.05)。其中,與NC組相比,miR-421[早期胃癌組:2.55(2.03,3.19),癌前病變組:1.67(1.14,2.45),NC組:0.42(0.39,0.55)]和miR-196b-3p[早期胃癌組:2.39(1.99,2.97),癌前病變組:1.65(1.16,2.18),NC組:0.83(0.70,0.98)]在早期胃癌組和癌前病變組明顯上調(P<0.05),且早期胃癌組miR-421和miR-196b-3p較癌前病變組上調更明顯(P<0.05)。進一步利用TCGA數據庫對組織標本中miRNA的表達進行了比較分析。結果顯示,miR-421在胃癌組織中呈高表達[0.098(0.072,0.146)],與在正常胃黏膜的表達[0.002(0.001,0.003)]相比,差異有統計學意義(P<0.001)。然而,miR-196b-3p表達在胃癌組織和正常胃黏膜之間比較[0.011 0(0.000 1,0.047 0)vs.0.009 0(0.000 1,0.042 0)],差異無統計學意義(P=0.079)。

2.2驗證集miR-421、miR-196b-3p和常規腫瘤標志物水平 在驗證集中,與NC組相比,癌前病變組和胃癌組血漿miR-421、miR-196b-3p水平明顯上調(P<0.05),且胃癌組血漿miR-421、miR-196b-3p水平高于癌前病變組(P<0.001)。此外,胃癌組CEA、CA125、CA211和CA50水平均明顯高于NC組和癌前病變組(P<0.05),CA199和CA724水平高于NC組(P<0.05)。癌前病變組血漿miR-421、miR-196b-3p、AFP、鐵蛋白、CA211、CA50水平明顯高于NC組(P<0.05)。見表1。

表1 驗證集NC組、癌前病變組和胃癌組血漿中miR-421、miR-196b-3p和常規腫瘤標志物水平比較[M(P25,P75)]

2.3miR-421、miR-196b-3p和腫瘤生物標志物對胃癌的診斷價值 將驗證集中NC組和癌前病變組作為對照,根據ROC曲線評估,血漿miR-421對胃癌的診斷準確性最高,AUC為0.931(95%CI:0.889～0.972)。進一步將miR-421、miR-196b-3p與傳統腫瘤標志物的診斷價值進行比較。結果顯示miR-421的AUC高于CEA、CA125、CA199、CA724、CA211、CA50診斷胃癌的AUC(P<0.05),同樣miR-196b-3p診斷胃癌的AUC也高于CEA、CA125、CA199、CA724診斷胃癌的AUC(P<0.05)。另外,miR-421的假陰性率也低于所有常規腫瘤生物標志物。見表2和圖1。

注:以NC組和癌前病變組作為對照。

表2 miR-421、miR-196b-3p和腫瘤標志物對胃癌的診斷價值

2.4血漿miR-421、miR-196b-3p對早期胃癌的診斷價值 進一步分析血漿miR-421、miR-196b-3p在早期(TNMⅠ期16例和Ⅱ期19例)胃癌患者中的診斷價值,將NC組和癌前病變組作為對照組。早期胃癌組血漿miR-421水平[3.50(2.19,5.22)]高于對照組[ 0.95(0.76,1.18)],差異有統計學意義(Z=6.751,P<0.001);早期胃癌組血漿miR-196b-3p[1.88(1.16,2.73)]水平高于對照組[0.97(0.75,1.24)],差異有統計學意義(Z=4.723,P<0.001)。將NC組和癌前病變組作為對照,繪制ROC曲線分析血漿miR-421、miR-196b-3p對早期胃癌的診斷價值。結果顯示:miR-421診斷早期胃癌的AUC為0.942(95%CI:0.886～0.997),靈敏度為88.61%,特異度為93.36%;miR-196b-3p診斷早期胃癌的AUC為0.809(95%CI:0.708～0.910),靈敏度為68.62%,特異度為86.75%。見圖2。

注:以NC組和癌前病變組作為對照。

2.5miR-421、miR-196b-3p和腫瘤生物標志物對癌前病變的診斷價值 將NC組作為對照,根據表1結果繪制ROC曲線,血漿miR-421或miR-196b-3p水平上調可以很好地區分癌前病變患者和NC組。血漿miR-421和miR-196b-3p診斷癌前病變的AUC分別為0.788和0.648,miR-421的AUC均高于miR-196b-3p、鐵蛋白、CA50診斷癌前病變的AUC(P<0.05),但是略低于CA211(P<0.05)。見表3和圖3。

注:以NC組為對照。

表3 miR-421、miR-196b-3p和腫瘤標志物對癌前病變的診斷價值

2.6驗證集胃癌組不同分期、癌前病變組及NC組miR-421和miR-196b-3p水平比較 驗證集癌前病變組與胃癌組TNM Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ/Ⅳ期之間miR-421、miR-196b-3p水平比較,差異均有統計學意義(P<0.05)。然而,胃癌Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ/Ⅳ期病例之間血漿miR-421和miR-196b-3p水平比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 驗證集胃癌組不同分期、癌前病變組及NC組miR-421和miR-196b-3p水平比較[M(P25,P75)]

3 討 論

迄今為止,還沒有可靠的無創性血液生物標志物用于診斷早期胃癌或癌前病變[9]。本研究首先通過微陣列篩選,確定了癌前病變和早期胃癌患者血漿miR-421和miR-196b-3p存在差異表達。進一步通過臨床血漿標本證實了這兩種miRNA對于癌前病變和胃癌患者有良好的診斷價值:早期胃癌和癌前病變患者血漿miR-421、miR-196b-3p水平明顯高于NC組; ROC曲線分析結果顯示,miR-421和miR-196b-3p在區分早期胃癌或癌前病變患者與NC組方面具有很高準確性。因此本研究結果表明,血漿miR-421和miR-196b-3p在診斷早期胃癌和癌前病變患者方面可能是有臨床意義的生物標志物。

miR-421定位在人類染色體1p34.23上,是 miR-200 家族的重要成員之一[10]。據KIM等[11]報道,胃癌組織和胃液中miR-421水平的升高可能對胃癌診斷有意義。這些結果與本研究的發現一致,即miR-421在胃癌患者中高表達,可能在胃癌中具有潛在的診斷價值。miR-196基因家族(miR-196a-1、miR-196a-2、miR-196b)是從人類同源盒(HOX)基因簇區域中含有3個基因(ECRG4、RAD23B和HOXA10)的區域轉錄而來[12]。miR-196a-1和miR-196a-2具有相同的成熟核苷酸序列,但成熟miR-196b與成熟miR-196a僅相差1個核苷酸[13]。在先前的研究中,miR-196b的大量表達抑制了ECRG4和RAD23B[14]。此外,HOXA10和miR-196b同時過表達的胃癌患者預后較差[15]。因此,miR-196b和HOXA10的過度表達可能介導因幽門螺桿菌引發慢性炎癥所導致的癌癥進展。但是目前關于miR-196b-3p在胃癌發病和進展中的臨床證據不足。在本研究中,miR-421和miR-196b-3p在區分胃癌患者與NC組及癌前病變組方面可以達到令人滿意的診斷效能,AUC分別為 0.931和0.804,尤其是miR-421,其AUC高于所有的常規腫瘤生物標志物,同樣miR-196b-3p的AUC也高于CEA、CA125、CA199和CA724?？傊?上述數據進一步闡明了這兩種miRNA作為新型腫瘤標志物的診斷價值。

提高胃癌的早期診斷率對于及時治療尤為重要。既往,研究人員已經闡明了幾種miRNA在早期胃癌診斷中的潛在作用[16-18]。盡管諸如miR-101之類的研究對胃癌的早期階段具有很高的診斷價值,但該研究不包括癌前病變,并且miRNA的細微變化和性能沒有進一步闡述。在本研究中,基于胃癌標本的詳細TNM分期特征,筆者探討了血漿miR-421和miR-196b-3p在早期胃癌中的診斷價值,結果表明,miR-421和miR-196b-3p都能較好地區分早期胃癌與對照組(NC組+癌前病變組),提示miR-421和miR-196b-3p在早期胃癌診斷中可能具有顯著的臨床價值。

癌前病變會使患胃癌的風險增加6倍以上[19]。以前的研究報道稱癌前病變受miRNA調節[20]。由于缺乏胃腸化生和非典型增生的臨床表現,臨床缺乏有效的無創檢測手段。幾種循環miRNA,特別是miR-196a、miR-18a、miR-21、miR-125b等,已被篩選出作為胃癌和癌前病變以及胃癌進展的早期標志物[21-22]。然而,這些miRNA與傳統腫瘤標志物在胃癌和癌前病變診斷中的比較價值尚未明確。最佳循環miRNA生物標志物應比傳統腫瘤生物標志物具有更好的特異度和靈敏度。在本研究中發現血漿miR-421和miR-196b-3p可以很好地區分癌前病變和NC組,AUC分別為0.788和0.648。尤其是miR-421的診斷效能明顯高于一些傳統的腫瘤生物標志物,如鐵蛋白和CA50。

胃癌的發生和發展是一個多階段的過程,miR-421、miR-196b-3p可能與某個階段或整個疾病過程有關[22]。本研究最后進一步分析了miRNA隨胃癌進展上調的趨勢。結果表明,血漿miR-421和miR-196b-3p水平在胃癌Ⅰ期病例中的表達與Ⅱ、Ⅲ/Ⅳ期無差異,但在發病早期(Ⅰ～Ⅱ期),已經能夠有效地區分胃癌和癌前病變,表明miR-421和miR-196b-3p上調最初是發生在癌前病變和早期胃癌中的。因此,本研究推測這兩種miRNA的上調可能是由致癌危險因素引發的,例如癌前慢性炎癥或幽門螺桿菌感染,但這需要進行詳細的調查。

綜上所述,本研究結果表明,血漿miR-421和miR-196b-3p可能是癌前病變和早期胃癌的潛在標志物。這項研究為臨床提供了關于這兩種miRNA在胃癌發病中作用的新見解。這些結果可能為開發用于早期胃癌診斷的新型生物標志物鋪平道路。這項研究的局限性在于樣本量相對較小,為單中心研究,缺少多因素分析等?？傊?miR-421和miR-196b-3p作為早期血漿生物標志物在癌前病變和胃癌臨床診斷中的確切用途應在使用較大樣本量的研究和臨床試驗中進一步探索。