水稻類病變突變體lms1的表型鑒定與抗病分子機制分析

余 瑤 王紫瑤 周思睿 劉鵬程 葉亞峰 馬伯軍 劉斌美,* 陳析豐,*

水稻類病變突變體的表型鑒定與抗病分子機制分析

余 瑤1王紫瑤1周思睿1劉鵬程1葉亞峰2馬伯軍1劉斌美2,*陳析豐1,*

1浙江師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 浙江金華 321004;2中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院, 安徽合肥 230031

類病變突變體是研究植物細胞死亡和抗病分子機制的重要遺傳材料。通過輻射誘變粳稻品種武運粳7號, 獲得一個少見的抗病性下降的類病變突變體()。與野生型相比, 該突變體葉片自發(fā)出現(xiàn)紅褐色斑點, 其株高、穗長、每穗粒數(shù)以及單株產(chǎn)量降低, 但千粒重增加; 對水稻白葉枯病的抗性顯著下降, 組織染色表明突變體的葉片中存在明顯的細胞死亡以及活性氧的過量積累。遺傳分析表明,突變體的表型受單隱性核基因控制, 利用圖位克隆技術(shù)將基因精細定位于水稻9號染色體Indel7和Indel8兩個分子標(biāo)記間, 物理距離為62 kb。定位區(qū)間內(nèi)候選基因的PCR擴增測序結(jié)果表明, 其中一個編碼泛素羧基末端水解酶的()基因第1個外顯子中插入了一段長度為654 bp的序列, 導(dǎo)致其蛋白翻譯提前終止。利用蛋白組學(xué)技術(shù)分析了突變體與野生型對照的蛋白積累水平, 共鑒定到19個差異蛋白(7個上調(diào)、12個下調(diào)), 主要參與氧化還原、葉綠素合成、光合作用等代謝途徑。上述結(jié)果為進一步研究基因的功能及其調(diào)控細胞程序性死亡與抗病性的分子機制提供借鑒。

水稻; 類病變;; 基因定位; 蛋白組學(xué)分析

類病變(,)是一類植物特有的、在沒有病原菌的侵染下便能自發(fā)形成類似病變表型的突變體。目前, 在擬南芥、玉米、大麥和水稻等植物中均發(fā)現(xiàn)了大量的[1-4], 尤其是水稻, 作為單子葉模式植物和重要的糧食作物, 已經(jīng)報道了200余種類病變相關(guān)突變體[5]。突變體與植物防衛(wèi)過程中的超敏反應(yīng)(hypersensitive response, HR)非常相似, 往往會表現(xiàn)出活性氧的迸發(fā)(oxidative burst)、防御相關(guān)(pathogenesis-related, PR)基因的誘導(dǎo)表達、細胞程序性死亡(programmed cell death, PCD)等表型。因此,是研究植物PCD與抗病分子機制的重要遺傳材料。目前, 已報道的絕大部分植物突變體表現(xiàn)出抗病性增強, 如、和等突變體增強了對白葉枯病的抗性[6-8],、和等突變體增強了對稻瘟病的抗性[9-11], 而、、、和等突變體則表現(xiàn)為廣譜的抗病性[12-16]。但是, 也有少數(shù)的抗病性沒有顯著性變化, 如水稻的、和等突變體[17]。

迄今, 從水稻類病變突變體中已經(jīng)成功克隆了40多個基因[18]。其中,基因編碼熱激蛋白轉(zhuǎn)錄因子HSFA4, 在細胞凋亡過程中起到負調(diào)控作用[4];基因編碼水稻中介復(fù)合體的第16亞基, 參與調(diào)控水稻的生長發(fā)育和防御反應(yīng)[19];基因編碼細胞色素P450單加氧酶, 參與調(diào)控葉綠體的發(fā)育[20];基因編碼一種含有CUE結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì), 過表達或抑制表達該基因均能產(chǎn)生類病變表型[21];基因編碼二氧四氫喋啶合酶, 參與核黃素的生物合成[22];基因編碼一個環(huán)型E3泛素連接酶, 能與OsBAG4互作, 觸發(fā)PCD和自身免疫應(yīng)答[16]。我們前期也克隆了一個水稻基因, 其編碼剪接因子復(fù)合體亞基SF3b3[23]。可見,基因的生物學(xué)功能非常多樣化, 同時也說明植物類病變形成的分子機制非常復(fù)雜, 只有克隆更多的相關(guān)基因, 才能全面深入地解析植物PCD與抗病應(yīng)答的分子機理。本研究利用人工輻射誘變, 從水稻品種武運粳7號的誘變庫中篩選到一個抗病性下降的突變體, 命名為(), 并對該突變體進行了表型鑒定、遺傳分析、基因克隆與蛋白組學(xué)分析, 為研究該基因的生物學(xué)功能與分子機制提供了一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

利用重離子束對粳稻(L. subsp.)品種武運粳7號進行輻射誘變, 篩選到具有類病變表型的突變體, 經(jīng)過多代自交, 其后代的突變表型遺傳穩(wěn)定。將突變體與秈稻(L. subsp.)品種9311雜交, F1代自交獲得F2分離群體, 在F2群體中選取具有突變體表型單株的葉片, 用于進行基因定位。以上材料均種植于浙江師范大學(xué)的水稻試驗田, 春季播種, 夏季移栽, 按照常規(guī)種植進行水肥管理。8個水稻白葉枯病菌(pv.,)生理小種PXO61、PXO86、PXO79、PXO71、PXO112、PXO145、PXO280和PXO124菌株, 由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院作物科學(xué)研究所提供。

1.2 葉片組織的生化分析

在水稻移栽后1個月左右, 在突變體植株剛出現(xiàn)類病變表型時, 分別取突變體與野生型(WT)對照武運粳7號相同時期、相同葉位的葉片, 分別進行以下試驗:

臺盼藍(Trypan blue, TB)染色[24]: 將葉片浸入含0.4%臺盼藍染液的離心管中, 抽真空處理30 min后, 黑暗放置12 h; 取出葉片, 轉(zhuǎn)移到含水合三氯乙醛的離心管中, 進行沸水浴脫色處理, 直至葉片完全褪綠。

四唑氮藍(nitroblue tetrazolium, NBT)染色[25]: 將葉片浸沒在0.2 mg mL–1NBT溶液的離心管中, 抽真空處理10～15 min后, 置于黑暗中染色8 h, 取出葉片放于95%乙醇中, 利用沸水浴進行脫色。

二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine, DAB)染色[26]: 將葉片浸泡在1 mg mL–1的DAB溶液(pH 5.8)的離心管中, 抽真空處理30 min后, 置于黑暗處染色8 h,取出葉片轉(zhuǎn)入96%乙醇中, 在沸水浴中進行脫色, 再次轉(zhuǎn)入95%乙醇中放置1～2 d。

活性氧含量及其酶活性測定: 采用H2O2含量檢測試劑盒(Solarbio)測定H2O2-含量, 采用POD活性檢測試劑盒(Solarbio)測定過氧化物酶(peroxidase, POD)活性, 具體操作方法均參照產(chǎn)品說明書。

1.3 水稻植株農(nóng)藝性狀調(diào)查

在成熟期, 隨機選取突變體與WT各10個單株, 分別統(tǒng)計株高、劍葉長、劍葉寬、有效分蘗數(shù)、穗長、穗粒數(shù)和結(jié)實率, 脫粒曬干后測量粒長、粒寬和千粒重等農(nóng)藝性狀; 取平均值, 計算標(biāo)準(zhǔn)差, 采用檢驗方法進行顯著性檢驗(< 0.05)。

1.4 葉綠素含量測定

突變體與野生型對照各取3個生物重復(fù), 葉片去掉主脈后, 每個樣品稱取0.1 g于15 mL的離心管, 每個管中加入3 mL 80%丙酮, 避光提取48 h以上; 以80%的丙酮為空白對照, 通過紫外分光光度計測量在664、647和470 nm處的OD值, 計算公式如下:

葉綠素濃度Chl= 13.71×A664–2.85×A647;

葉綠素濃度Chl= 22.39×A647–5.42×A664;

類胡蘿卜素濃度Car = (1000×A470–3.27×Ca– 104×Cb)/229;

葉綠素或類胡蘿卜素含量公式(mg g–1) = (c×V×n)/ (1000 m)。

式中, c: 葉綠素或類胡蘿卜素濃度; V: 提取液體積, 單位為mL; n: 稀釋倍數(shù); m: 質(zhì)量, g。

1.5 白葉枯病抗性鑒定

將菌株在PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯300 g、蛋白胨5.0 g、瓊脂17 g、蔗糖15 g、Na2HPO4·12H2O 2.0 g、Ca(NO3)2·4H2O 0.5 g, 加蒸餾水定容至1000 mL, pH 7.0)上接種, 于28℃培養(yǎng)2～3 d, 刮取菌落于適量無菌水中, 配制成1×109cfu mL–1菌懸液備用。在水稻分蘗盛期, 采用剪葉法[27]進行接種, 用消毒的剪刀先沾取菌液, 在完全展開的葉片頂端剪去2～3 cm,使其從傷口處侵染, 接菌14 d后測量接種葉片的病斑長度。

1.6 突變體lms1的遺傳分析與目標(biāo)基因精細定位

首先, 對突變體的表型進行遺傳分析, 通過觀察該突變體與9311雜交后F1植株、F2植株的表型, 統(tǒng)計F2群體中WT與突變表型的單株數(shù), 計算WT與突變表型的分離比, 并進行χ2檢驗, 確定表型的顯隱性、以及是否由單基因控制等。目的基因的定位采用圖位克隆(map-based cloning)技術(shù)[28], 其中, 水稻葉片組織的基因組DNA提取采用CTAB法[29], 分子標(biāo)記的PCR擴增體系為10 μL: 5 μL 2× PCR Mix (TaKaRa)、1 μL DNA模板、0.5 μL 10 μmol L–1引物、3.5 μL ddH2O。PCR程序為: 94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 55～60℃ 30 s, 72℃ 30 s, 35個循環(huán); 72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用4%瓊脂糖凝膠電泳, 100 V電壓進行分離, 再經(jīng)溴化乙錠(EB)染色, 在凝膠成像儀中照相。目的基因的初步定位采用水稻已公布的SSR標(biāo)記[30], 精細定位自行開發(fā)了8個Indel標(biāo)記, PCR引物見表1。

1.7 候選基因的PCR測序與序列分析

采用高保真DNA聚合酶KOD-FX (TOYOBO)對WT和突變體的基因組DNA中候選基因()進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系含25 μL 2× PCR buffer、2 μL DNA模板、10 μL 2 mmol L–1dNTPs、2 μL 10 μmol L–1引物(表2)、10 μL ddH2O、1 μL KOD FX。PCR程序為: 94℃ 5 min; 98℃ 10 s, 60℃ 30 s, 68℃ 2 min, 30個循環(huán); 68℃ 10 min。將PCR產(chǎn)物寄送浙江尚亞生物技術(shù)有限公司(杭州), 并使用引物進行兩端測序。PCR引物lms1-Chr.9用于鑒定基因中是否有654 bp的片段插入, PCR引物lms1-Chr.3用于鑒定3號染色體上是否有相應(yīng)的片段缺失(表2)。采用2×PCR Mix試劑盒(TaKaRa)進行PCR擴增, 反應(yīng)體系和操作均按照產(chǎn)品說明操作, PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行分離, 經(jīng)EB染色后, 在凝膠成像系統(tǒng)中照相。

表1 用于基因精細定位的分子標(biāo)記及引物序列

表2 用于目標(biāo)基因擴增和鑒定的PCR引物

將OsLMP1蛋白的氨基酸序列與植物基因組數(shù)據(jù)庫PLAZA (https://bioinformatics.psb.ugent.be/plaza/)進行Blastp比對, 獲得其在其他植物中的同源蛋白, 采用MEGA7.0軟件對蛋白序列進行Alignment分析, 并用最大似然法(Maximum Likelihood)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹, Bootstrap值設(shè)定為1000[31]。

1.8 蛋白組學(xué)分析

在水稻分蘗期, 突變體類病斑表型開始出現(xiàn)后, 分別取突變體與WT相同時期、相同葉位的葉片, 各3個生物學(xué)重復(fù), 共6個樣品, 經(jīng)液氮速凍后, 使用植物蛋白提取試劑盒(Solarbio)提取總蛋白, 采用聚丙烯酰胺凝膠電泳和BCA (bicinchnininc acid)法測定蛋白質(zhì)量與濃度[32]。對樣品蛋白質(zhì)進行還原以及烷基化處理后, 每個樣品分別取100 μg蛋白質(zhì)進行酶解消化, 收集經(jīng)脫鹽處理的肽段進行非標(biāo)定量法(Label-free)定量分析[33]。通過毛細管高效液相色譜儀將混合后的肽段進行組分分離, 并采用LC-MS/MS對肽段組分進行測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻類病變突變體lms1的表型鑒定

在苗期, 突變體的葉片上會出現(xiàn)零星的褐色斑點(圖1-A), 隨著植株的生長發(fā)育, 其葉片的斑點逐漸增多, 到結(jié)實期時其劍葉、倒二葉、倒三葉等都布滿褐色斑點且葉色發(fā)黃(圖1-B, C), 葉片的葉綠素含量顯著低于WT (圖1-D), 呈現(xiàn)早衰表型。類病變表型的出現(xiàn)往往是由于細胞壞死引起的, 對突變體葉片剛出現(xiàn)斑點時(圖1-E), 將葉片進行臺盼藍染色后, 發(fā)現(xiàn)突變體葉片上有許多藍色斑, 表明此處的細胞正在死亡, 而同時期的WT葉片染色后則沒有(圖1-F)。活性氧(reactive oxygen species, ROS)的積累是引起PCD的主要原因, 因此, 對同時期的突變體葉片進行了NBT (檢測O2–)和DAB (檢測H2O2)染色, 與野生型對照相比, 突變體的葉片分別出現(xiàn)了深藍色(圖1-G)和紅褐色斑點(圖1-H), 表明突變體的葉片中ROS過量積累。上述結(jié)果表明突變體葉片表現(xiàn)的是類似HR壞死斑, 屬于典型的類病變表型。盡管絕大多數(shù)類病變在一定程度上能提高突變植株對病原菌的抵抗力, 但是突變體對8個水稻白葉枯病菌株的抗性卻明顯下降(圖1-I, J)。從農(nóng)藝性狀上看,突變體的生長與發(fā)育受到抑制, 其株高、穗長、每穗粒數(shù)、結(jié)實率和單株產(chǎn)量等主要性狀均顯著性低于WT (圖2-A～G, L), 其粒長(圖2-H, M)和粒寬(圖2-I, N)與WT沒有顯著性差異, 但是千粒重卻顯著高于WT (圖2- K), 千粒重增加的主要原因可能是突變體穗粒數(shù)減少導(dǎo)致種子的灌漿更充分, 使得粒厚增加(圖2-J, O)。

(圖1)

A: 苗期植株; B: 成熟期植株; C: 旗葉; D: 葉綠素含量測定; E: 染色前的葉子; F～H: 分別被TB、NBT和DAB染色后的葉子; I: 被菌株感染的葉片照片; J:菌株感染葉片病斑長度的統(tǒng)計(用刻度尺測量病斑長度, 每個類型水稻至少測量15片劍葉, 最終取平均值作為其病斑長度)。使用檢驗測量顯著性差異(*:< 0.05; **< 0.01, 下同), 標(biāo)尺為2 cm (A, C～G, I～J), 標(biāo)尺為10 cm (B)。

A: plants at the seedling stage; B: plants at the mature stage; C: flag leaves. D: chlorophyll contents. E: leaves before staining; F–H: leaves stained by TB, NBT, and DAB, respectively; I: photographs of the leaves infected bystrains; J: statistical results of the lesion length in the leaves infected bystrains (Measure the length of the diseased spot with a graduated ruler, measure at least 15 sword leaves for each type of rice, and finally take the average value as its diseased spot length). A two-tailed unpaired Student’s-test determined the statistical significance (hereafter). *:< 0.05; **< 0.01. Bar: 2 cm in (A, C–G, I–J), 10 cm in (B).

2.2 水稻lms1突變體的遺傳分析

水稻突變體植株經(jīng)過多代的自交, 其類病變表型能穩(wěn)定遺傳。將粳稻背景的突變體與秈稻9311雜交, 其F1代植株表型均無類病變表型; F1代植株自交得到包括1468個單株的F2代群體, 對F2群體中的WT類型植株和類病變植株的數(shù)量進行了調(diào)查統(tǒng)計, 發(fā)現(xiàn)WT為1114株、類病變?yōu)?54株, 經(jīng)χ2檢驗符合孟德爾遺傳規(guī)律的3∶1分離比(χ2= 0.63;> 0.05), 這表明突變體的類病變性狀受單隱性核基因控制。

2.3 突變體lms1目標(biāo)基因的精細定位與測序鑒定

利用已公布的水稻SSR標(biāo)記對突變體與秈稻9311兩個雜交親本進行PCR擴增, 篩選到分布于12條染色體的85對多態(tài)性分子標(biāo)記。利用上述多態(tài)性標(biāo)記對基因進行連鎖分析, 發(fā)現(xiàn)的類病變表型在水稻9號染色體上存在連鎖, 并利用42個F2代群體中突變表型的單株將目的基因初步定位在Indel1和RM24683之間(圖3-A)。隨后, 通過擴大F2突變表型單株的數(shù)目至354株, 進一步將該基因精細定位于Indel7和Indel8之間, 物理距離為62 kb (圖3-B)。根據(jù)水稻參考基因組數(shù)據(jù)庫(http: //rice.uga.edu/index.shtml)的注釋信息, 此區(qū)間內(nèi)包含9個注釋基因(圖3-C)。為了確定突變位點, 我們對定位區(qū)間內(nèi)的所有注釋基因進行PCR擴增和測序分析, 通過比較WT與突變體的序列, 發(fā)現(xiàn)突變體中基因的第一個外顯子中插入了一段長度為654 bp的序列, 從而導(dǎo)致其編碼蛋白翻譯提前終止(圖3-C, D), 其他基因及其啟動子序列均未發(fā)生突變。

圖2 水稻lms1突變體與WT的主要農(nóng)藝性狀比較

A～L: 分別為株高、旗葉長、旗葉寬、有效分蘗數(shù)、穗長、每穗粒數(shù)、結(jié)實率、粒長、粒寬、粒厚、千粒重和單株產(chǎn)量; M～O: WT和突變體的10粒種子的長度、寬度和厚度的照片, 標(biāo)尺為1 cm。

Statistical results of plant height (A), flag-leaf length (B) and width (C), effective tiller number (D), panicle length (E), grains number per panicle (F), setting ratio (G), grain length (H), grain width (I), grain thickness (J), 1000-grain weight (K), and yield per plant (L); photograph of 10 grains in length (M), width (N) and thickness (O) between WT andmutant, scale bar: 1 cm.

該插入的654 bp序列與水稻基因組比對, 發(fā)現(xiàn)其來源于水稻3號染色體的短臂。由于突變體是輻射誘變而來, 我們推測輻射可能導(dǎo)致3號和9號染色體同時產(chǎn)生了DNA鏈的斷裂, 3號染色丟失了一段序列, 在修復(fù)過程中被連接到9號染色體長臂上, 發(fā)生染色體易位(translocation) (圖3-E)。為了進一步證實這一推測, 我們在2個位點分別設(shè)計了PCR引物進行擴增, PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果顯示在突變體中3號染色體的區(qū)段發(fā)生了片段丟失, 而9號染色體發(fā)生了片段插入(圖3-F)。對3號染色體的PCR產(chǎn)物進行測序, 證實丟失的序列就是插入到9號染色體基因的片段。同時, 我們用3號染色體的這對PCR引物, 對F2群體中呈現(xiàn)類病變表型的單株進行了擴增, 結(jié)果表明的類病變表型與3號染色體處的片段丟失不存在連鎖現(xiàn)象, 表明突變體的類病變表型是由于9號染色體上基因的功能缺失所導(dǎo)致的。根據(jù)文獻[34]顯示,基因是近期被報道的類病變基因(),編碼一種去泛素化酶,是基因的等位變異。

A, B:的初步定位和精細定位, “”代表使用的F2群體中突變型單株的數(shù)量, 每個標(biāo)記物下方的數(shù)字表示該標(biāo)記檢測到的重組體數(shù)量; C: 62 kb區(qū)域內(nèi)的注釋基因以及候選基因的突變位點, 在第一個外顯子上的第625 bp位點插入了一個654 bp的片段; D:中目標(biāo)基因在突變位點的測序結(jié)果及與WT的對比, 黑框里為整個插入序列的片段; E:突變體染色體易位模式圖, DSB, DNA雙鏈斷裂; NHEJ, 非同源末端連接; F: 利用突變位點兩側(cè)引物對WT和擴增后的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。M代表DL2000分子標(biāo)記。

A and B: preliminary and fine mapping genetic map of themutant; ‘’ refers to the number of F2mutants used; the number under each marker represents the recombinants detected by corresponding marker. C: annotation genes in the 62-kb region, and the mutation site of the candidate gene of; a 654-bp fragment was inserted into target gene at the 625 bp from the first codon. D: sequencing results ofgene in the mutation site comparing to WT, and the sequence boxed is the whole fragment inserted. E: model diagram of chromosome translocation inmutant. DSB, DNA double-strand break. NHEJ, non-homologous end joining; F: electrophoresis of PCR products amplified from WT andusing primers pair flanking by the mutation sites. M: molecular marker DL2000.

2.4 水稻OsLMP1蛋白的進化分析

OsLMP1蛋白屬于UBP (ubiquitin-specific proteases)亞家族的一員, 包含鋅指結(jié)構(gòu)域和肽酶C19結(jié)構(gòu)域。其中, 肽酶C19結(jié)構(gòu)域中具有2個保守的催化基序: 半胱氨酸盒(Cysteine, Cys Box)和組氨酸盒(Histidine, His Box) (圖4-A), 具有泛素水解酶的活性,可以通過切割肽鍵, 參與多泛素前體和泛素化蛋白的加工[34]。利用水稻OsLMP1蛋白序列, 在PLAZA植物基因組數(shù)據(jù)庫中搜到萊氏衣藻()、小立碗蘚()、擬南芥()、玉米()等25個物種的42個同源蛋白, 并構(gòu)建了OsLMP1的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4-B), 從OsLMP1的同源蛋白的保守性和進化來看, 該基因起源于陸生植物分化之前, 在進化上其主要功能結(jié)構(gòu)域較為保守, 在不同物種中可能存在相似的生物學(xué)功能。

2.5 水稻OsLMP1下游通路的蛋白組學(xué)分析

由于OsLMP1參與翻譯后的蛋白水平調(diào)控, 我們利用Label-free蛋白質(zhì)組技術(shù)比較了突變體與WT的蛋白組, 共篩選到19個差異蛋白(|log2FC|≥1), 其中7個蛋白含量增加, 12個蛋白含量降低(表3)。差異蛋白的GO分析結(jié)果顯示: 以生物過程(biological process)分類, 主要涉及光合作用(GO: 0015979)、氧化還原(GO: 0055114)等; 以細胞器組成(cellular component)分類, 主要富集在質(zhì)體、胞內(nèi)膜細胞器、葉綠體中; 以分子功能(molecular function)分類, 大多與氧化還原酶活性相關(guān)(圖5-A)。對差異蛋白的KEGG Pathway富集分析表明, 主要富集在萜類生物合成、基礎(chǔ)代謝途徑、光合作用、卟啉和葉綠素代謝等途徑(圖5-B)。

在這些差異蛋白中, Q8W250是脫氧木酮糖磷酸鹽還原異構(gòu)酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase, DXR), 作為萜類化合物合成途徑之一的一種限速酶[35], 其含量下調(diào)會抑制突變體中的萜類物質(zhì)的合成。過氧化物酶(peroxiredoxin, POD)作為植物抗氧化的一種物質(zhì), 可以清除H2O2, 保護DNA和膜不被破壞[36], 其中Q69TY4在中下調(diào), 而另外一種過氧化物酶POD, 即Q7F1U0卻上調(diào), 用試劑盒測定后, 發(fā)現(xiàn)中積累了大量的ROS, POD的活性顯著高于野生型, 暗示后者可能發(fā)揮主效功能(圖5-C, D)。香葉酰香葉醇還原酶基因(CHLP, EC: 1.3.1.111)是葉綠素(Chl)生物合成最后一步的關(guān)鍵酶, 參與葉綠素生物合成的末端氫化步驟[37-38], 即Q75IM9; A2Y8E0是鐵氧還蛋白- NADP+-氧化還原酶(FNR, Ferredoxin-NADP+-Oxi-doreductase)介導(dǎo)鐵氧還原蛋白(Fd)與NADP+之間的電子轉(zhuǎn)移, 是卡爾文循環(huán)中提供還原力的關(guān)鍵酶; Q84YK8是一種脂肪酸氧化酶, 其產(chǎn)物通常可以作為茉莉酸生物合成的中間體, 脂肪酸的過氧化物會使葉綠體的光反應(yīng)失活并破壞細胞膜結(jié)構(gòu)[39]。在突變體中Q75IM9和A2Y8E0表達下調(diào), 而Q84YK8上調(diào)表達, 這就解釋了的葉綠素含量減少, 葉片黃化, 光合作用減弱, 從而使得大部分農(nóng)藝性狀下降, 尤其單株產(chǎn)量。

(圖4)

A: OsLMP1及其同源蛋白的序列比對, 下畫線和框里為保守結(jié)構(gòu)域; B: OsLMP1蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹, 由MEGA v7.0軟件用最大似然法構(gòu)建, bootstrap=1000。

A: sequence alignment of OsLMP1 and its homologous proteins, and the conservation domain were underlined or boxed; B: phylogenetic tree of OsLMP1 proteins. The Maximum-Likelihood tree was generated by MEGA v7.0 with bootstrap-1000 repeats tests.

表3 差異表達蛋白的基本信息

a: 蛋白質(zhì)ID來自于UniProt (https://www.uniprot.org/);b: 基因ID來自于日本晴基因組數(shù)據(jù)庫(http://rice.uga.edu/index.shtml)。

a: protein ID comes from UniProt (https://www.uniprot.org/);b: gene ID comes from According to the reference genome of Nipponbare (http: //rice.uga.edu/index.shtml).

(圖5)

A:突變體和WT之間的差異蛋白(DEP)的GO分析; B: DFP的KEGG富集, X軸表示富集率, Y軸表示KEGG途徑, 氣泡的大小表示蛋白質(zhì)的數(shù)量, 顏色表示值的大小; C: H2O2的含量; D: POD的活性。

A: GO analysis of the differentially-expressed proteins (DEPs) betweenmutant and WT; B: KEGG enrichment of the DEPs. The X-axis indicates the enrichment ratio, the Y-axis indicates the KEGG pathway, and the bubble size indicates the number of proteins. The color represents the enriched-value; C: content of H2O2. D: POD activity.

3 討論

本研究對一個水稻類病變突變體進行了表型鑒定, 該突變體出現(xiàn)典型的類病變, 但是與其他已發(fā)現(xiàn)的類病變突變體不同, 其抗病性顯著降低; 通過圖位克隆方法精細定位了基因, 并確定了其突變表型是由于編碼去泛素化酶的目標(biāo)基因的突變所導(dǎo)致, 其與近期報道的類病變突變體[34]一樣都是基因的等位變異。水稻突變體是由于基因的編碼區(qū)插入了1個堿基, 導(dǎo)致蛋白翻譯提前終止, 缺失了His-box及其去泛素化酶的活性, 使得組蛋白H2B泛素化和組蛋白H3-K4me3/4甲基化水平升高, 激活SA合成基因和的表達, 提高了植株對PXO99的抗性[34]。然而, 我們獲得的突變體雖然類病變表型與突變體非常相似, 但是卻對PXO61、PXO71等多個水稻白葉枯病菌的抗性普遍下降, 這可能是由于本研究中的突變位點不同, 突變體本身呈現(xiàn)出早衰, 其基礎(chǔ)免疫能力降低所導(dǎo)致。同時, 也不排除接種病原菌的發(fā)育時期不同, 以及突變體遺傳背景的差異引起了突變體對白葉枯病菌的抗性不同。蛋白組學(xué)的分析結(jié)果也表明控制萜類物質(zhì)合成途徑的限速酶DXR在突變體中積累減少(表3), 可能是其導(dǎo)致抗病性下降的重要原因之一, 其Q84YK8上調(diào)會促進JA合成, JA可以拮抗SA, 因此, 也有可能產(chǎn)生與突變體抗病相反的表型。當(dāng)然, 也可能是2個突變體的基因的變異方式不同所引起的,突變體是插入一個堿基, 而突變體則是插入了一大段序列, 盡管都導(dǎo)致了基因移碼突變, 但是閱讀框移碼的位置及其后面錯譯的氨基酸序列都有不同, 產(chǎn)生的生物學(xué)作用也可能不同。

水稻突變體是通過人工用重離子束輻射誘變得到的。一般來說, 重離子束會造成密集性的DNA團簇發(fā)生損傷, 涉及DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand break, DSB)、DNA單鏈斷裂(DNA single-strand break, SSB)等類型, 損傷發(fā)生時會有同源重組(homologous recombination, HR)和非同源末端連接(non-homologous end joining, NHEJ)兩個途徑對其修復(fù)[40]。有趣的是, 在突變體中, 位于9號染色體的基因中插入了一段來自3號染色體的一個654 bp片段, 而在3號染色體的原位點處又剛好丟失了這段序列(圖3-E, F)。由此可見, 在重離子束輻射下, 3號染色體的DSB造成了一個654 bp片段的斷裂脫離, 同時9號染色體上也出現(xiàn)了DSB, 在修復(fù)過程中恰好與來自3號染色的脫離片段進行連接, 導(dǎo)致片段插入, 形成了染色體的片段易位。之后對F2群體的突變單株進行擴增, 發(fā)現(xiàn)不存在連鎖現(xiàn)象, 這表明突變體類病變的發(fā)生與3號染色體上片段缺失沒有關(guān)系, 而是由9號染色體基因的插入突變導(dǎo)致的。

此外, 水稻類病變的發(fā)生往往會影響植株的生長發(fā)育, 其主要農(nóng)藝性狀均比WT更差, 尤其是籽粒性狀, 如[20]、、、、、[41-44,10]等突變體的千粒重都減少。而突變體的千粒重則顯著增加, 其主要表現(xiàn)為粒厚的增加, 粒長和粒寬沒有顯著的差異。研究表明, 水稻粒厚調(diào)控的關(guān)鍵基因就是編碼一種功能性去泛素化酶, 其突變體缺失去泛素化酶的活性, 會導(dǎo)致粒厚、粒寬和粒重有所增加[45]。與OsLMP1同屬于UBPs (ubiquitin-specific proteases)家族的OsUBP15也是一種泛素特異性蛋白, 參與水稻籽粒的形態(tài)調(diào)控[46]。當(dāng)然, 由于突變體的有效分蘗數(shù)和穗粒數(shù)顯著減少, 同時結(jié)實率降低, 因此相比于野生型, 在灌漿期突變體中會殘留更多的碳水化合物, 而在穎殼大小定形以后, 這些化合物會使得突變體灌漿更充分, 進而呈現(xiàn)出粒厚和千粒重的增加。此外, 已知Q84YK8上調(diào)會促進JA合成, JA合成關(guān)鍵酶Kat-2B又會促進小麥粒重的增加, 那么這個突變粒厚增加是不是也與JA合成關(guān)鍵酶Kat-2B相關(guān)[47], 這就需要我們進行更深一步的研究, 總的來說該基因的克隆可以為水稻抗性和粒型研究提供重要的遺傳資源。

4 結(jié)論

通過對水稻突變體的表型觀察與生理生化分析, 發(fā)現(xiàn)基因會導(dǎo)致植株的葉片出現(xiàn)斑點及黃化的表型, 使得水稻葉片中存在大量細胞死亡, ROS積累; 水稻中的葉綠素含量也顯著下降, 對白葉枯病的抗性減弱。基因位于水稻9號染色體, 是編碼一種去泛素化酶基因的新的等位基因, 其是在第一個外顯子中插入了一段長度為654 bp的序列, 導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯提前終止, 造成水稻植株出現(xiàn)紅褐色病斑, 抗病性減弱及種子粒厚增加等表型, 這為后續(xù)揭示水稻的抗病機制以及培育高抗優(yōu)質(zhì)水稻奠定基礎(chǔ)。

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Phenotypic identification and disease resistance mechanism analysis of rice lesion mutant

YU Yao1, WANG Zi-Yao1, ZHOU Si-Rui1, LIU Peng-Cheng1, YE Ya-Feng2, MA Bo-Jun1, LIU Bin-Mei2,*, and CHEN Xi-Feng1,*

1College of Life Science, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, Zhejiang, China;2Hefei Institutes of Physical Science, Chinese Academy of Science, Hefei 230031, Anhui, China

Lesion mimic mutants are important genetic materials for studying molecular mechanisms of plant cell death and disease resistance. Through radiation mutagenesis of arice cultivar ‘Wuyunjing 7’, a rare lesion mimic and disease-susceptible mutantwas obtained. Compared to the wild type, the leaves of this mutant spontaneously appeared reddish-brown spots, and its plant height, panicle length, number of grains per panicle, and yield per plant decreased, but the weight of 1000-grain increased. In addition, the resistance ofto rice bacterial blight decreased significantly, and tissue staining showed significant cell death and excessive accumulation of reactive oxygen species in the mutant leaves. Genetic analysis showed that the phenotype of themutant was controlled by a single recessive nuclear gene, and thegene was finely located between two molecular markers, Indel7 and Indel8, on chromosome 9 of rice with a physical distance of 62 kb. PCR amplification and sequencing of candidate genes in the localization interval showed that a 654 bp sequence was inserted into the first exon of the() gene, which encodes a ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase, resulting in premature termination of protein translation. The protein compositions ofmutants and WT controls were analyzed by a proteomics technology, which identified a total of 19 differentially accumulated proteins (7 upregulated and 12 down-regulated), mainly involved in redox, chlorophyll synthesis, photosynthesis, and other metabolic pathways. The above results provide a reference for further research on the function of thegene and its molecular mechanism of regulating programmed cell death and disease resistance.

rice; lesion mimic;; gene mapping; proteomic analysis

10.3724/SP.J.1006.2024.32010

本研究由國家自然科學(xué)基金項目(32071987, 32101697)和浙江省自然科學(xué)基金項目(LQ22C130005, LZ23C130004)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (32071987, 32101697) and the Natural Science Foundation of Zhejiang Province (LQ22C130005, LZ23C130004).

劉斌美, E-mail: liubm@ipp.ac.cnl; 陳析豐, E-mail: xfchen@zjnu.cn;

E-mail: 2315318441@qq.com

2023-03-27;

2023-10-23;

2023-11-23.

URL: https://link.cnki.net/urlid/11.1809.S.20231122.1419.002

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